抗体偶联药物（ADC）凭借其单克隆抗体的特异性，旨在将细胞毒性药物精准递送至癌细胞，同时最大限度地降低对健康组织的毒性，是当前肿瘤治疗领域备受瞩目的创新力量。然而，ADC复杂的分子结构也使其在开发过程中面临聚集、错误折叠等挑战，可能严重影响其药代动力学、药效乃至引发免疫原性。

2026年3月，一篇发表于Cancers杂志的综述文章^[1]，对ADC的生物物理和结构表征技术展开深入探讨，并强调在早期研发阶段运用这些技术的重要性。通过精确测量熔解温度（T_m）、药物抗体比（DAR）、靶标亲和力、自缔合与聚集、共价修饰及构象变化等关键参数，可有效识别并规避潜在问题，显著降低后期昂贵的体内实验和临床试验风险。文章还前瞻性地展望了外源基质研究和人工智能/机器学习（AI/ML）在加速ADC开发中的应用潜力，为构建更高效、更安全的ADC研发流程指明了方向。本文特将相关内容整理如下，以飨读者。

ADC的研发挑战

ADC的关键参数与表征技术

T_m代表蛋白质或其结构域50%折叠时的温度，而聚集温度（T_agg）则指蛋白质开始聚集的温度。以上两个参数都可以用来衡量蛋白质的热稳定性，因此在开发过程中，它们有助于选择出稳定性较好的蛋白质或配方。差示扫描量热法（DSC）是一种广泛使用的蛋白质热稳定性检测工具，通过测量蛋白质热变性引起的热焓变化（∆H），揭示影响分子折叠和稳定性的因素，T_m越高表明热稳定性越强。既往一项研究通过将工程化肽段偶联至Fc区，制备了Fc区T_m更高的ADC，作者将其归因于偶联肽段对Fc区分子动力学或熵的限制。另有研究观察到，与单克隆抗体相比，特定位点偶联载荷的ADC热稳定性有所降低——DSC检测到ADC的CH₂结构域Tm降低，而差示扫描荧光法（DSF）则进一步发现C_H2和Fab结构域的T_m均有所降低，提示偶联载荷可能导致ADC结构稳定性下降。此外，圆二色谱（CD）亦可用于报告蛋白质的二级结构含量，并通过监测CD信号随温度变化来确定T_m。

DAR是ADC设计和疗效的关键参数，表示每个单克隆抗体偶联的细胞毒性载荷分子数量，其典型值可从2到8不等。虽然体外研究中较高的DAR可能看似更有效，但研究发现，DAR较高的ADC血浆清除率往往高于DAR较低的ADC，这可能与DAR和ADC疏水性之间的正相关关系有关。测定ADC DAR的常用技术包括通过紫外或可见光吸收测量单克隆抗体和载荷各自最大吸收波长（最大吸收波长）处的吸光度来计算平均DAR。色谱法，如疏水相互作用液相色谱（HIC）和反相高效液相色谱（RP-HPLC），能进一步量化平均DAR并表征药物偶联分子的分布，既往研究即利用HIC研究了DAR对ADC稳定性和疗效的影响。完整质谱（MS）则能提供总抗体、游离载荷和偶联ADC的定量信息，以及共价修饰和翻译后修饰（PTM）的分布，有研究曾通过天然质谱监测体内DAR和游离药物浓度的变化。

ADC的抗体组分须具备高靶点特异性和高抗原结合亲和力，以确保载荷的精准递送。解离常数（Kd）常用于量化抗体与抗原间的亲和力，Kd值越低，结合亲和力越高。表面等离子共振（SPR）、生物层干涉（BLI）和酶联免疫吸附测定（ELISA）是常用的配体结合技术，用于测量结合强度和速率。有研究将SPR应用于卵巢癌ADC开发，成功筛选出具有理想亲和力和增强内化能力的抗体－靶点对。另一研究则利用BLI识别了用于治疗实体瘤的抗GD2 ADC。

蛋白质的自缔合与聚集是ADC开发中的重大挑战，尤其在高浓度制剂中。自缔合指溶液中分子间弱的、非共价引力导致的聚集，可引发高粘度、相分离及不可逆聚集。蛋白质聚集可能导致不良免疫原性，从而降低治疗效果，因此预测自缔合风险至关重要。第二维里系数（B₂）可衡量稀溶液中分子间的非特异性相互作用，正值表示排斥，负值表示吸引。动态光散射（DLS）和静态光散射（SLS）是测量B₂的常用方法。有研究利用DLS揭示ADC中结构修饰可增加蛋白质-蛋白质相互作用，而另一研究比较两种ADC后发现，带负电荷末端基团的ADC吸引相互作用显著增加，即便其载荷疏水性较低。分析超速离心（AUC）和尺寸排阻色谱（SEC），尤其是SEC-MALS（SEC联用SLS技术）也被广泛用于检测和量化蛋白质聚集体。

ADC在生产、储存和给药过程中易发生共价修饰，包括N－连接糖基化、糖化、氧化、脱酰胺和异构化。这些修饰会改变单克隆抗体的热力学稳定性、疏水性、结构和电荷，增加聚集风险，并可能导致免疫原性和影响血浆半衰期。MS技术常与色谱联用，为糖基化状态和聚糖组成提供见解。去糖基化可升高IgG1聚集率，而Fc N-聚糖对Fc受体（FcR）相互作用及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等效应功能至关重要。糖化作为非酶促修饰，影响电荷异质性和聚集。有研究利用质谱成功识别并量化了德曲妥珠单抗的糖化及其他PTM。氧化和脱酰胺是最常见的化学降解方式，甲硫氨酸和色氨酸易被氧化，天冬酰胺易脱酰胺。此外有研究发现，ADC的互补决定区（CDR）中天冬酰胺脱酰胺可能影响抗原结合和细胞毒性。琥珀酰亚胺中间体形成不仅限于脱酰胺，天冬氨酸和谷氨酸也易受影响。另有研究发现琥珀酰亚胺在CDR中积累会降低其效力。也有研究利用液相色谱-质谱（LC-MS）表征了吡咯并苯二氮卓（PBD）ADC中天冬氨酸的异构化，观察到结合力变化，提示可能导致三级结构改变。

硫醇-马来酰亚胺连接体是已批准ADC的常见连接体，但其可能与人血清白蛋白（HSA）中的游离半胱氨酸残基反应，形成白蛋白连接体－载荷加合物，导致脱靶毒性。其他连接体降解机制包括酸性降解及血浆和溶酶体蛋白酶裂解。有研究曾利用血浆孵育结合质谱方法评估ADC的生物转化，并通过酶解和肽图分析定位修饰。ELISA也可用于测量血浆孵育后载荷的丢失。连接体裂解测定对于理解载荷释放机制及控制其释放以防脱靶毒性至关重要，可根据触发因素分组：酶促裂解、酸不稳定裂解和氧化还原不稳定裂解。

单克隆抗体作为动态分子，在共价修饰、配体结合或环境变化后可能展现出构象变化。氢氘交换质谱（HDX-MS）是一种高分辨率溶液基技术，可探测蛋白质构象和动力学变化。有研究利用HDX-MS研究位点特异性ADC的结构完整性，发现药物偶联仅轻微扰动了C_H2结构域的骨架酰胺氢键网络，并未影响单克隆抗体的整体结构完整性。此外有研究则通过固态HDX-MS研究了赋形剂对ADC储存稳定性的影响。