作者：谭诗梓，南华大学衡阳医学院；杨宛宜，南华大学附属南华医院放射科；左朝晖，中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院(湖南省肿瘤医院)
外泌体作为一类携带生物活性物质的载体，在疾病诊疗中展现出巨大潜力，但针对外泌体的研究却以基础研究居多。外泌体的安全性和有效性已初步获得临床试验验证，并逐步拓展至更大规模的患者群体进行深入探索。这不仅提示外泌体在医学领域具有较高研究热度，而且为外泌体的临床应用提供了充足的科学依据。
外泌体是由细胞分泌的纳米级囊泡(直径30~150 nm)，具有脂质双分子层结构，携带源自亲本细胞的多种生物活性分子，包括核酸、脂质、跨膜蛋白和胞质蛋白等，是细胞通信的重要“信使”。外泌体的临床应用研究较为广泛，涵盖疾病诊断与预后评估的生物标志物、药物递送载体、癌症治疗靶点、免疫系统调节及组织工程与再生医学的新型治疗模式等领域。尽管将外泌体应用于疾病诊疗极具潜力，但其临床推广仍面临诸多难题，例如载药策略、外泌体与药物比例、治疗剂量设定以及药物可控释放等方面仍缺乏统一标准。
值得注意的是，治疗性外泌体需在生物体内完成递送并实现靶标部位有效蓄积后，才能发挥其最佳治疗潜能。但目前已有的基础研究与临床试验中均存在外泌体数据结果异质性较大的问题，这主要受限于缺乏高效的示踪技术，导致难以对递送后的外泌体生物分布、靶向效率及药代动力学特征进行实时动态监测与精准评估，同时也影响了对外泌体体内作用机制的分析。
外泌体示踪技术可有效监测研究对象体内植入的外泌体生物分布情况与动态代谢变化，而借助先进的成像手段进行外泌体体内监测，将有助于明确治疗性外泌体所需数量、注射频率和时间、给药途径及归巢效率等关键参数。因此，研发精确可靠的成像技术对追踪外泌体运动轨迹、优化治疗参数、提高疗效至关重要。本文总结临床常用的外泌体示踪技术，并重点分析外泌体
1. 临床常用的活体内外泌体示踪技术
外泌体的临床应用较为广泛，在生物医学研究领域，外泌体示踪常借助多种成像技术，例如光学成像、光声成像(photoacoustic imaging，PAI)、计算机断层扫描(computed tomography，CT)、核成像及MRI 等。光学成像利用光捕捉物体、组织或材料的图像，在医疗诊断、材料科学和通信等多个领域中均有应用，其中荧光成像(fluorescence imaging，FLI)和生物发光成像(bioluminescence imaging，BLI)构成了光学成像的核心部分。
MRI 作为临床应用广泛、扫描技术成熟的成像手段，具有无电离辐射、安全可靠、适用于软组织成像及高分辨率重复成像等优势，能实现对外泌体的非侵入性追踪。临床实际应用中，为增强MRI 对外泌体的辨识能力，多采用MRI 造影剂标记外泌体后再植入活体。
根据弛豫调控机制，外泌体标记常用的MRI 造影剂可分为以下3 类：1)纵向弛豫时间(longitudinal relaxation time，T1)造影剂(阳性造影剂，如含钆的物质)，其机制是缩短T1，在T1 加权成像(T1-weighted imaging，T1WI)中呈现高信号，从而增强图像对比度；2)横向弛豫时间(transverse relaxationtime，T2)造影剂(阴性造影剂，如含铁的物质)，其机制是缩短T2， 在T2 加权成像(T2-weighted imaging，T2WI)中诱导信号衰减，突出目标组织；3)含氟示踪剂[ 如氟-19 磁共振成像(fluorine-19 magneticresonance imaging，19F-MRI)]，其机制是基于19F直接检测，不依赖弛豫时间调控，可实现无背景干扰的特异性成像，特别适用于低浓度目标的检测。
这些造影剂与示踪剂的应用显著提升了MRI 的成像效果及图像精准度，为医学研究和临床实践提供了丰富、准确的信息。根据载药方式的不同，外泌体MRI 标记策略可分为外源性标记与内源性标记。其中，外源性标记是使用MRI造影剂直接处理外泌体；内源性标记则是借助共孵育或转基因等生物工程技术改造亲本细胞，使其分泌的外泌体能够自然携带MRI 对比剂。
2. 外泌体MRI外源性标记
2.1 T1造影剂标记外泌体
研究发现用于外泌体示踪的对比剂形式多样，包括脂质体、胶束纳米颗粒、碳纳米结构以及聚合物包覆的金属纳米粒子等。其中， 含钆(gadolinium，Gd)和含锰(manganese，Mn)的对比剂通常归类为T1造影剂。目前，临床上开展增强MRI诊断多优先采用T1 造影剂， 尤其是钆基造影剂(gadolinium based contrast agents，GBCAs)，其具有缩短质子T1来加速成像的优势，同时对运动伪影敏感性较低，可获得更高质量的图像。
研究表明GBCAs 可用于活体内外泌体追踪。Abello 等应用超声与膜挤压技术将Gd-脂质体成功标记于人脐带间充质干细胞来源的外泌体中，并使用14.1 T MRI 检测标记的外泌体在荷瘤模型小鼠中的生物分布；待静脉注射标记的外泌体24 h 后，小鼠肝蓄积量达到最高，其次为肿瘤组织，提示Gd-脂质体外泌体标记法并未显著改变外泌体的理化性质。
Rayamajhi 等通过类似方式标记外泌体，并使用3.0 T MRI 证实Gd 标记的外泌体(gadolinium-labeled exosomes，Gd-Exo)不仅具有高度的胶体稳定性，而且保留了蛋白质特性与分子功能；值得注意的是，该实验结果还表明Gd-Exo 在体内与体外均对癌细胞表现出较强的靶向性，可用于癌症诊断和治疗监测。与同类产品
研究证实使用GBCAs 示踪对外泌体理化性质和蛋白质功能的影响甚微，但GBCAs的毒副作用在一定程度上限制临床应用。研究发现Gd主要通过肾排泄，将其应用于肾功能受损患者会导致Gd清除速率显著降低，延长Gd暴露时间，因此GBCAs严禁用于肾衰竭患者；同时，GBCAs 还与肾源性系统性纤维化(nephrogenic systemic fibrosis，NSF)的发生密切相关。
基于T1WI 的研究显示：大脑深层灰质结构高信号与GBCAs暴露有关，经尸检证实该影像学异常系Gd沉积所致，但尚无证据表明大脑Gd沉积会引发有害后遗症。美国食品药品监督管理局(U.S. Foodand Drug Administration， FDA)指出过敏反应为GBCAs 常见不良反应，而
FDA不良事件报告系统最新数据显示GBCAs可能导致
2.2 T2造影剂标记外泌体
基于氧化铁研发的纳米材料广泛应用于各种疾病的诊断。相较于传统的GBCAs，超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)能有效缩短T2，同时兼具良好的生物相容性和高灵敏度，或可增强MRI 的诊断效能。其中， 超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒(ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles，USPIONs)直径为4~6 nm，具有物理和化学性质稳定、生物相容性佳、易被外泌体内化、生物利用度高等优点，尤其适用于长期动态的活体外泌体示踪研究。
此外， 与含Gd 和含Mn 的造影剂相比，SPIONs毒性较低。多项研究表明：基于SPIONs 标记的外泌体磁响应特性显著增强，可受外部磁场的操控，并在磁场撤除后迅速恢复非磁性状态，这一特性使其能够在磁场影响下精准停留在目标区域，并能应用磁分离技术成功实现药物的靶向递送，为解决天然外泌体缺陷提供创新有效的方案。
Hu 等利用电穿孔技术将USPIONs载入
基于“肿瘤缺氧微环境”“新生血管异常”“免疫抑制特性为细菌定植创造有利条件”等理论或认识，Wei 等设计了肿瘤相关细菌响应型磁性外泌体，即负载超小氧化铁纳米颗粒的外泌体(exosome loaded extremely small iron oxide nanoparticles，Exo@ESIONs)，其由巨噬细胞来源的外泌体经电穿孔负载USPIONs 构建而成， 在生理条件下，USPIONs 聚集于外泌体内充当T2造影剂；在病理条件下，Exo@ESIONs 受肿瘤相关细菌分泌的成孔毒素影响而快速分解并释放USPIONs，实现肿瘤靶向T1 MRI。
Exo@ESIONs 具有血液循环时间长、肿瘤组织蓄积量高、肿瘤微环境反应迅速等优点，有助于肿瘤早期诊断。有研究采用超声法使神经祖细胞来源的外泌体负载USPIONs，体外MRI 显示标记的外泌体T2缩短，并获得了更高的低信号对比度，为研究外泌体在神经生物学中的作用提供了可视化的工具；然而，该研究仅开展体外实验，并未验证体内实验的有效性与安全性，也未探讨USPIONs 标记对外泌体生物学功能的影响，因而需要进一步开展体内实验以深入探讨标记外泌体的效应。
在活体内，直径>80 nm的SPIONs 易被巨噬细胞迅速捕获而代谢为不稳定的铁离子，而直径较小的SPIONs 则能够逃避巨噬细胞的捕获，在循环系统中存在数小时至数天。因此，直径>80 nm的SPIONs非常适合用于网状内皮系统成像，例如肝病变检测中的SPIONs 制剂Feridex®(菲立磁)和Resovist®(铁羧葡胺)。正常肝组织中富含库普弗(Kupffer)细胞，发生恶性病变的肝组织中则缺乏Kupffer 细胞，而SPIONs 的短T2信号衰减效应可精准实现组织特异性显影，即正常肝实质中Kupffer 细胞主动吞噬SPIONs呈现MRI 低信号特征，恶性病变肝实质区域则因缺乏Kupffer 细胞的主动吞噬效应呈现高信号特征。
需要注意的是，SPIONs 在生物体内代谢转化为不稳定铁离子而非通过外排途径清除，且部分SPIONs 具有显著的代谢抗性，可在肝组织中长期滞留，从而诱发铁过载介导的氧化应激及组织损伤等毒性效应。此外， 氧化铁纳米颗粒的表面特性可以经芬顿(Fenton)反应和哈勃-韦斯(Haber-Weiss)反应的催化作用介导活性氧的产生，对细胞、组织和器官造成损伤。采用USPIONs标记技术可检测到少量外泌体，但USPIONs 作为阴性造影剂，其聚集产生的低信号可能受出血、钙化、金属沉积等背景信号干扰，易导致误诊。
此外，T2造影剂的高磁矩可能干扰局部磁场，引发高光溢出效应，导致成像区域扩大，进一步降低T2WI的分辨率。目前，针对SPIONs标记的外泌体检测主要通过对比植入前与植入后的“低信号像素数量”或“低信号区域体积” 等形态学参数进行半量化分析，其难以准确追踪显示外泌体动态分布特征，GBCAs 标记的外泌体检测也存在类似问题。
3. 外泌体MRI内源性标记
3.1 T2造影剂内源性标记外泌体
外源性标记策略是应用人工合成的MRI 对比剂标记目标外泌体，而后将其载入生物体内来实现成像监测与分析，但该策略难以直接追踪生物体内自然生成的、源自亲本细胞的外泌体动态变化。内源性标记技术是将生物体内自然存在的基因或蛋白质作为标志物，用于监测和评估生物体内的特定过程或现象，具有较高的特异性和稳定性。在生物体内天然合成的MRI 报告蛋白中，铁蛋白以其独特的结构特性成为应用最广泛的代表。
铁蛋白是一种由24 个亚基组成的球形蛋白质复合物，其亚基主要包括重链和轻链。其中，重链亚基具有独特的铁氧化酶活性，能够将Fe²+催化氧化为Fe³+，并促进铁核心在蛋白质空腔内的矿化，形成铁氧氢氧化物纳米颗粒。这一特性使得铁蛋白在MRI 示踪中具有重要的应用价值。
Liu 研究团队通过分子工程技术构建了嵌合型融合蛋白，其功能结构域包含铁蛋白重链(ferritin heavy chain， FTH1) 与跨膜蛋白乳黏素(lactadherin)两大核心组件，其中FTH1结构域赋予融合蛋白MRI信号示踪功能，lactadherin 结构域则通过膜整合机制实现对外泌体膜的特异性锚定；研究者将携带该融合蛋白的慢病毒转染至细胞，促使外泌体在生物合成过程中自发整合融合蛋白，最终成功获取FTH1标记的外泌体。
虽然FTH1 过表达可在一定程度上抑制细胞增殖，但并未显著改变外泌体的固有特性，且可利用MRI 追踪体内、体外FTH1 标记的外泌体。相较于SPIONs，过表达FTH1 的细胞毒性更低，并在MRI检测中可维持稳定的低信号对比度，信号强度不随时间衰减，为活体内外泌体的长期追踪提供关键技术支撑。
Busato 等采用USPIONs 与脂肪干细胞共孵育获得USPIONs 标记的外泌体，并基于4.7 TMRI检测结果证实仅需5 μg标记的外泌体(含0.032 μg铁)即可实现体内MRI示踪，展现出显著的低剂量示踪优势。Kutchy 等采用类似的标记方式成功获得USPIONs 标记的星形胶质细胞来源的外泌体，且标记过程不影响外泌体的正常释放；经鼻腔给药后，MRI检测显示标记的外泌体在24 h 内可分布于大脑、肝、肾等部位，对相应脏器疾病的治疗具有重要的意义。研究发现与电穿孔法相比，共孵育法标记效率较低，但能在不损伤外泌体膜结构的前提下，减少或避免游离USPIONs 的残留，提高标记外泌体的安全性和纯度。
3.2 19F-MRI示踪剂标记外泌体
GBCAs存在的毒副作用和SPIONs标记存在的低特异性均在一定程度上影响其临床应用，而电穿孔、超声、膜挤压等外泌体标记方法则存在外泌体膜损伤和生物活性分子丢失等问题。为了克服这些限制，研究者将目光转向19F-MRI 技术。研究发现生物体内天然氟含量远低于MRI 检测下限值，通过外源性氟化探针标记外泌体后，其19F 信号强度与标记颗粒量呈正相关，从而实现了外泌体的定量检测。
高氟支链探针(PERFECTA)作为一种含有36 个磁性等效19F 原子的19F-MRI 探针，凭借其优异的生物相容性和卓越的成像性能成为研究热点。Sancho-Albero等采用与PERFECTA相容的
4. 外泌体MRI 标记在临床转化中面临的挑战
外泌体MRI 标记在临床转化中面临3 大核心挑战：外泌体标记方式的影响、造影剂或示踪剂的选择与影响，以及外泌体自身特性的影响。外泌体标记方式中，外源性标记方法如电穿孔法和超声法存在造成外泌体膜破裂的风险，或可改变外泌体蛋白质组成并影响其功能。采用USPIONs标记亲本细胞时，细胞增殖可导致纳米颗粒含量稀释，降低标记外泌体的铁含量。此外，外泌体降解后释放的造影剂可能沉积于组织中而产生假阳性信号，影响诊断准确性。
基于常规负载的纳米颗粒含量，MRI 分析仅能间接指示外泌体位置，且灵敏度有限，要实现外泌体示踪则需要负载更高含量的纳米颗粒。外泌体内源性标记的效果非常明确，但任何涉及亲本细胞的基因操作都可能存在恶性转化风险，难以通过临床审批。研究显示采用基于共价键结合的标记策略可实现钆喷酸葡胺对外泌体的标记，不仅有效避免了外泌体膜结构损伤，而且显著提升了标记外泌体的T1弛豫效率。
造影剂的影响主要聚焦于潜在的毒副作用，尤其是GBCAs作为临床主流选择时，其毒副作用的缓解策略成为研究热点：1)研发高弛豫效率GBCAs 以降低给药剂量；2)筛选对Gd3+解离、跨金属反应更具惰性的配合物；3)借助分子靶向技术提高造影特异性并减少剂量；4)探索并研制替代Gd的新一代MRI造影剂。
例如，Pu 等合成了新型蛋白类Gd3+造影剂ProCA32，其在保持高Gd3+结合选择性的同时显著提升了弛豫效率；在此基础上，其又研发出针对
目前，SPIONs 类造影剂只在少数国家使用，且多款商业化产品已停售，原因可能包括：1)作为阴性显像剂，SPIONs 类造影剂存在低信号与出血、钙化等病理改变难以区分的情况；2)高磁矩特性易引发磁化率伪影，扭曲邻近正常组织或背景磁场，导致病变周围图像模糊；3)T2造影剂微粒尺寸较大(通常为60~180 nm)，体内清除速度缓慢，可能带来长期的副作用；4)T2WI处理时间长于T1WI。针对上述问题，通过开发T1/T2 双模态造影剂、优化扫描参数、减小造影剂粒径、升级数据采集与处理硬件等措施，有望提高图像诊断准确率，减少磁化率伪影，加快造影剂代谢，缩短成像时间，最终推进SPIONs 类造影剂的临床高效应用。
外泌体自身存在的诸多问题：1)缺乏标准化的分离及纯化流程，临床级外泌体产能不足；2)外泌体标记过程受药物特性、标记方式、外泌体来源及其内在稳定性等多种因素制约，影响标记效率及标记后稳定性；3)天然外泌体在体内易被巨噬细胞捕获，靶向能力欠佳；4)外泌体的给药途径、剂量、给药时间及其生物分布、药代动力学和免疫原性等方面的机制尚未明晰。
为了加速外泌体临床转化进程，建议采取以下有效策略：1)运用新技术(如微流控芯片)提高外泌体产量；2)优化标记方式(如采用脂质体融合、化学偶联)增强标记效率与稳定性；3)经表面修饰靶向分子来改善外泌体靶向递送能力；4)深入开展体内研究及临床试验，全面评估外泌体的诊疗效能及生物安全性。
5. 结语与展望
MRI 具有空间分辨率高、能够对深层组织中的外泌体进行长期动态监测等优势，但其临床推广仍面临诸多挑战。新型成像技术及多模态成像技术的发展为外泌体的活体示踪及临床转化提供了新的思路。磁粒子成像(magnetic particle imaging，MPI)作为一种尚处于研究阶段的非侵入性活体断层成像技术，可用于追踪SPIONs 分布。相较于依赖间接信号衰减检测的MRI技术，MPI能直接量化SPIONs 的电子磁化强度，具有灵敏度高、特异性强、无电离辐射及信号不随组织深度衰减等优势。
Toomajian 等将SPIONs 标记的外泌体分别注射至荷瘤小鼠和健康小鼠体内，并采用MPI 显示这些外泌体在原发肿瘤部位以及转移灶的聚集特性。多模态成像技术融合了多种成像手段，通过多维度验证提升成像精准性，是未来影像学领域的研究热点。
Liu等将SPIONs和荧光染料Cy7(cyanine 7)载入外泌体，并巧妙结合MPI与FLI 技术开展外泌体示踪，为前列腺癌的精确诊断开辟新途径。Zhao等研发了超小型Mn磁修饰硒化银量子点，其不仅具有高近红外荧光量子产率与高弛豫率(约为商业造影剂钆喷酸葡胺的4 倍)，而且能即时高效地标记EVs，实现活体内EVs的长期、无创、高分辨率的双模态追踪，实时量化其动态生物分布特征。
综上所述，外泌体具有广阔的临床应用前景，而成像技术的快速发展为探究活体内外泌体的生理活动(如细胞间信息交换、基因调控、干细胞归巢与迁移等)提供了强有力的技术支撑。未来研究将进一步明晰外泌体的生理作用及应用价值，为实现外泌体诊疗的临床转化筑牢基础。
来源：杨宛宜,谭诗梓,左朝晖.外泌体磁共振成像示踪[J].中南大学学报(医学版),2025,50(02):301-312.
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