作者：张天宇,吴亚玲,胡殿兴,王世宣等，华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科

卵母细胞成熟的动态过程包括了细胞核成熟、细胞质成熟及表观遗传学成熟三个主要方面。有别于精子成熟过程,卵母细胞在第1次减数分裂的双线期时会出现1个独特的减数分裂停滞时期,这一时期是卵母细胞的细胞核发育与细胞质发育进行同步化的关键时期[1]。C型利钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)是一种在哺乳动物雌性生殖系统中有着高表达水平的短肽分子,CNP与其主要的C型利钠肽受体B(natriuretic peptide receptor B,NPR-B)共同介导的CNP/NPR-B通路在维持卵母细胞的减数分裂阻滞状态中发挥着不可或缺的调控作用。CNP分子相关的信号通路可能参与了多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)的发生和发展,为PCOS的发病机制研究及临床治疗提供新的方向。在辅助生殖技术中,CNP分子的应用能够用于优化部分细胞状况较差的卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation,IVM)。本文基于基础与临床研究,对CNP在卵母细胞成熟中的作用、机制及临床应用的研究进展进行综述。

1　C型利钠肽及其受体的概述

CNP分子是一种由22个氨基酸组成的短肽分子,于1990年自猪的脑组织中被提纯和测序,成为利钠肽分子家族的新成员。由于其早期在啮齿类动物、猪及禽类的脑组织中被发现存在高表达水平,CNP起初被分类为特异性表达在脑组织中的一种神经肽分子[2],后续的研究也逐步确定了CNP在血管发生及软骨性骨化中有不可或缺的调控作用[3]。编码CNP的Nppc基因在不同物种之间具有高保守性,其核苷酸序列在人类、猪及小鼠中拥有高达95%的同源性,CNP分子亦在上述不同物种中有着高度相似的结构,并且肽链中所不同的部分氨基酸组成并不会对其生物功能造成显著影响。迄今为止,CNP存在3种结构相似但功能略有差异的受体,其中NPR-B是与CNP的亲和力最高的一种,发挥主要的信号转导效应以激活下游通路,发挥生物学效应,NPR-C主要参与了对利钠肽的生物清除作用,而NPR-A则与CNP亲和力最低,主要负责与其他的利钠肽结合发挥效应[4]。

研究发现CNP/NPR-B在哺乳动物的卵巢中也有特异性表达并且受到了性腺轴的调控,提示其可能与卵巢功能存在潜在的联系[5]。在雌性小鼠中对NPR-B编码基因敲除后,小鼠不仅由于严重的软骨发育不全而表现侏儒症,并且由于卵巢功能异常丧失了生育力。研究人员观察到在出生后100 d时,NPR-B编码基因敲除后的雌性小鼠的卵巢体积与质量相较于野生型小鼠的卵巢有明显降低,并且基因敲除小鼠的卵巢中几乎不存在黄体结构,表明基因敲除后其失去了正常排卵功能。此外,基因敲除小鼠的子宫内膜及肌层的厚度都相较于野生型小鼠明显下降,这些初期的实验结果提示了CNP及其受体NPR-B可能在雌性生殖系统特别是卵巢的正常发育及功能的维持中有不可或缺的作用[3]。

2　C型利钠肽维持卵母细胞减数分裂阻滞的分子机制

卵母细胞的正常减数分裂过程会在卵母细胞减数分裂的第一前期的双线期时发生停滞以阻止卵母细胞的过早成熟,任何干扰到这一独特减数分裂停滞过程的事件都可能会造成卵子成熟的异常并最终损害生殖功能[6]。早在1980年就有研究者在对卵母细胞、卵丘细胞和壁颗粒细胞进行分别培养时发现壁颗粒细胞能够通过旁分泌的方式产生某些未知的卵母细胞成熟抑制因子(oocyte maturation inhibitor,OMI)并通过卵泡液继续作用于卵丘细胞和卵母细胞,继而抑制卵母细胞的过早成熟[7]。在小鼠中构建的编码NPR-B的基因功能性失活小鼠模型也出现了由于卵母细胞的减数分裂过早恢复,而导致卵母细胞生发泡破裂异常的生育力丧失[8]。

CNP在后来被验证是一种对卵母细胞成熟所必不可少的OMI。CNP的生物学效应的产生依赖于其受体NPR-B上的羧基末端鸟苷酸环化酶结构域B,羧基末端鸟苷酸环化酶结构域B的胞质单跨膜结构可以催化三磷酸鸟苷产生胞内第二信使环磷酸鸟苷(cGMP)。在啮齿动物中的实验研究结果表明,壁颗粒细胞是卵泡中CNP的主要来源,卵母细胞本身并不表达NPR-B,CNP在与主要表达于卵丘细胞上的NPR-B结合后催化三磷酸鸟苷产生cGMP[9];所产生的cGMP又可作为第二信使通过卵丘细胞之间的间隙连接最终传导进入卵母细胞,cGMP在进入卵母细胞后抑制磷酸二酯酶3A的酶活性,继而阻止环磷酸腺苷(cAMP)向单磷酸腺苷的转化,在卵母细胞中所维持的高浓度cAMP会激活蛋白激酶A并继续激活磷酸酶复合体Wee1/Myt1,以磷酸化失活成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)的重要组成部分———细胞周期依赖性激酶(CDK1),随着MPF的功能失活,卵母细胞的减数分裂过程发生阻滞[10]。当月经期中来自于垂体后叶释放的黄体生成素达到峰值时,CNP/NPR-B的表达水平降低,并失去通过上述信号通路维持第1次减数分裂阻滞的能力,卵母细胞减数分裂继续进行且同源染色体分离完成,发生卵母细胞生发泡破裂[11]。

3　C型利钠肽表达异常与多囊卵巢综合征卵母细胞

成熟障碍的关系PCOS是好发于育龄期妇女的生殖内分泌疾病,其发病机制及临床表现复杂,包括典型的无排卵、高雄激素血症和胰岛素抵抗等异常特征[12]。研究发现,PCOS患者卵巢中所出现的过量未排卵窦卵泡可能与卵母细胞的减数分裂阻滞异常有密切的联系[13]。Wang等[14]基于脱氢表雄酮诱导构建了PCOS小鼠模型,在无排卵的PCOS小鼠卵巢中发现CNP/NPR-B信号通路表现出持续性高表达,且与雄激素的高表达相关,这在Zheng等[15]的研究中也同样得到了证实。Wang等[14]对这类无排卵小鼠使用外源性绒促性素(HCG)或雄激素受体或雌激素受体抑制剂使得减数分裂恢复及排卵恢复的同时,降低了卵巢中CNP/NPR-B的表达水平。这也再次验证了Kawamura等[16]的早期研究中得到的HCG可以降低Nppc基因转录水平从而降低CNP表达的结论。值得一提的是尽管目前仍然无法明确血清中的CNP水平是否主要受到卵巢分泌的影响,Özay等[17]的一项使用小规模人血清样本的研究报道中CNP的水平并未与血清雄激素水平有明显的关系,但是PCOS患者血清中的CNP水平显著高于健康女性血清中的水平,提示CNP仍然与PCOS的发病机制存在潜在联系。

相较于来源于正常卵巢组织的卵母细胞,Harris等[18]的研究发现从PCOS患者获得的卵母细胞在减数分裂的过程中更容易发生染色体数目异常减少的现象,基于CNP/NPR-B通路调节卵母细胞减数分裂阻滞的机制以及上述研究的发现,PCOS患者卵巢中过度表达的CNP/NPR-B通路可能异常地将卵母细胞抑制在第1次减数分裂阶段,从而造成细胞核成熟与细胞质成熟的不同步,致使卵母细胞的减数分裂进程受到干扰,最终表现为卵巢中异常不排卵卵泡的产生。然而,也有研究证实未成熟的卵母细胞在卵巢中发生排卵的可能性仍然是存在的[19],在此考虑到排卵和卵母细胞成熟并非是一种完全的耦合关系,现有的研究还不足以证明CNP/NPR-B通路在PCOS动物模型卵巢中的过度激活是否会通过引发卵母细胞减数分裂阻滞异常,从而造成卵母细胞成熟障碍并最终表现出大量不排卵卵泡的特征,未来仍然需要更深入的研究对相关分子机制进行证实。

4　C型利钠肽在卵母细胞体外成熟中的应用

卵母细胞IVM技术是指将未成熟的卵丘-卵母复合体(cumulus-oocyte complex,COC)自未成熟的小窦卵泡中取出,之后在体外将COC中的卵母细胞诱导发育至第2次减数分裂的MⅡ期,之后再进行卵胞浆内单精子注射及胚胎移植的新型辅助生殖技术[20]。IVM在一些特定的应用场景中,有着不可替代的地位,对于存在卵母细胞发育迟缓且不成熟的PCOS患者[21]以及卵巢高反应风险易发生卵巢过度刺激综合征的需要进行辅助生殖支持的患者[22],临床上应当采取相较于传统的控制性卵巢刺激更为安全的低剂量促排卵方案,以保证患者不出现卵巢过度刺激相关的并发症,同时获得并未成熟的卵母细胞继而进行IVM以最终达到安全辅助生殖的目的;此外,对于因癌症、特殊职业等原因采取了生育力保存的女性,自其所冻存的卵巢组织获取的人工复苏后的卵母细胞亦处于未完全成熟的状态,继续进行IVM也是提高其卵母细胞质量并保证最终辅助生殖成功的重要处理步骤[23]。

然而,在上述临床情况中对COC进行传统性的IVM方案时,有基于细胞学和遗传学的研究表明,在针对这些质量不佳的卵母细胞进行IVM的过程中容易发生卵母细胞染色体减数分裂过早恢复与细胞质成熟不同步的时序问题,细胞质中的微管、肌动蛋白丝和染色质无法发生正常的交互以完成染色体的正常分离,继而对细胞的不对称性形成造成不良影响并致使极体形成发生异常,此外,细胞骨架的成熟时间不足也对卵母细胞中的细胞器重排造成不良影响,最终出现卵母细胞质量降低与不满意的临床妊娠率[24]。

为了解决这一问题,近年来的研究从抑制卵母细胞减数分裂的恢复并维持卵丘细胞与卵母细胞的间隙连接通信的角度出发,开发出了基于应用CNP的卵母细胞体外成熟前培养技术(prematuration culture,pre-IVM)技术,以合理延长卵母细胞减数分裂阻滞状态的时间,为卵母细胞成熟过程中所需子的合成提供时间,改善卵母细胞的质量,这一方案在近年来成为了IVM技术发展中的一个新方向[25]。Ang等[26]的动物实验发现,使用CNP体外培养小鼠的窦前卵泡时,可以十分有效地抑制颗粒细胞迁移的发生,维持卵母细胞周围颗粒细胞的数量和CNP水平,保持卵泡处于窦前期并延长卵母细胞的减数分裂阻滞状态,给予卵母细胞更多的发育成熟时间。Soto-Heras等[27]在对山羊的卵母细胞使用了这种拥有额外pre-IVM步骤的双相IVM方案后,发现添加了CNP的双相IVM方案可以将卵母细胞在体外的减数分裂阻滞状态维持时间延长至6 h之久,也促进了颗粒细胞来源的跨透明带凸起(granulosa cell transzonal projections,GC-TZPs)的表达以加强卵丘细胞与卵母细胞的通信,此外该双相IVM方案还增加了卵母细胞内谷胱甘肽水平,降低了活性氧(ROS)水平,并最终提高了卵细胞发育为囊胚的比率和胚胎的发育潜能。在人类中,对COC进行基于CNP的pre-IVM方案也取得了新的进展,Sánchez等[28]收集了PCOS患者的小卵泡进行基于CNP的pre-IVM方案,发现CNP在体外可将COC的减数分裂阻滞状态维持时间延长达46 h,且应用CNP对COC进行成熟前培养后再进行常规IVM可以将COC的成熟率由常规IVM的49%提升至70%(P<0.001),此外,这种pre-IVM方案将常规IVM后的优质囊胚率由8%提升至18%(P<0.01),最终可移植的Day 3胚胎率也由23%提升至了43%(P<0.001)。

在接受了根治性卵巢切除术并且需要生育力保存的患者中,Kirillova等[29]收集了切除的卵巢组织中的窦卵泡,并对其中未成熟的COC首次应用了添加CNP的pre-IVM方案,结果表明这种双相IVM方案相较于传统IVM方案将卵母细胞成熟率提高了21%,且将传统方案中11%的卵母细胞闭锁率降低至2%。这些结果的出现可能是由于CNP能够降低卵丘细胞转移率并维持卵丘细胞与卵母细胞之间的细胞通信,从而保证卵丘细胞对卵母细胞的代谢调控[30]。这项研究首次发现对来源于离体人卵巢组织的COC进行pre-IVM方案是可行的,但是由于研究样本的稀缺性造成样本量较小,未来仍然需要更大规模的深入研究来充分证实其可行性和安全性,以增加更多患者进行生育力保存的可能性。

5　小　结

作为一种高度保守的短肽分子,CNP维持着卵母细胞的减数分裂阻滞状态,对卵母细胞成熟有着不可或缺的作用。CNP/NPR-B通路在PCOS动物模型中的高表达,提示其在PCOS的发病机制或进展中的潜在作用。在辅助生殖中,CNP的应用有望推进卵母细胞IVM技术的发展,在使用质量欠佳的卵母细胞时提供一种IVM的补救方案,给予患有PCOS或有生育力保存需要等患者更为可靠的辅助生殖支持。然而,未来仍需更加深入的基础及临床研究以确定基于CNP的新型IVM技术的遗传安全性、有效性及潜在受益人群。

参考文献略。

来源：张天宇,吴亚玲,胡殿兴,等.C型利钠肽在卵母细胞成熟中的作用及机制研究进展[J].实用妇产科杂志,2025,41(05):378-381.

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