作者：李波,杨喆东,师娟子等，西北妇女儿童医院生殖中心

中国目前约有4000万不孕不育患者,且每年以数十万的速度递增[l] 。不孕不育症的发生率约占育龄夫妇的l5%～20%,其中50%的不孕不育与男性因素有关。对于3次或3次以上精液离心后镜检未发现精子,同时排除不射精和逆行射精等即可诊断为无精子症。临床上将无精子症分为梗阻性无精子症(OA)和非梗阻性无精子症(NOA)两种类型,男性不育中最为棘手的类型之一即NOA,它是由于各种病因引起的睾丸生精小管受损,精子生成障碍,从而表现出无精子的症状[2-4] 。近年来,通过外科手术在显微镜下获得精子(micro-TESE)已经被广泛的应用于NOA患者的治疗中,但是依然有60%的患者无法找到精子[4] ,它们也无法通过卵胞浆内单精子注射(ICSI)获得后代。而近年来发展出来的圆形精子细胞注射(ROSI)技术为这类患者带来了希望。

一、ROSI的理论基础

精子发生是一个连续的过程,起始于精原干细胞,经过两次减数分裂后,形成具有中心体的单倍体圆形精子细胞,圆形精子细胞通过复杂而显著的变化发育为不同长度的精子细胞和精子。单倍体的圆形精子细胞是睾丸中减数分裂完成度最高的细胞,但是其并不具备使卵母细胞受精的能力。在正常情况下,如果有圆形精子细胞存在于睾丸中,则也会有精子。但是,如果发生基因突变等原因导致精子发生阻滞,则会引起无精子症[5] 。He等[6] 发现人类男性Crem基因突变会导致生精功能障碍,继而导致精子发生阻滞在圆形精子细胞期。Ayhan等[7] 也发现人类男性两种常染色体隐性基因TAF4B和ZMYNDl5突变后,在睾丸中也只能发现圆形精子细胞。Amjad等[8] 研究发现,没有精子或者晚期精子细胞的NOA患者中大约有58%拥有单倍体的圆形精子细胞。Ogura等[9] 通过ROSI成功获得了正常出生的小鼠,这是全世界的首例报道,同时也证明了圆形精子细胞具有使卵母细胞受精和发育的能力。Tesarik等[l0] 从NOA男性的精液中提取到圆形精子细胞,并用于ROSI治疗,卵母细胞能够成功受精并且可以持续发育,移植后生育了2名健康的婴儿。随后也有类似治疗成功的报道[ll-l2] 。虽然ROSI为部分NOA患者带来了生育后代的希望,但是其安全性也备受争议。圆形精子细胞为未成熟的精子细胞,部分圆形精子细胞的中心体可能也是未成熟的,未成熟的中心体会影响雄性和雌性原核的融合[l3] 。圆形精子细胞的DNA和组蛋白结合比较松散,ROSI技术绕过了精子成熟过程中父源印记基因的重编程,可能会干扰父源和母源印记基因的建立和维持,影响ROSI后胚胎的表观遗传。Zhu等[l4] 研究发现,ROSI的胚胎早期m RNA表达模式和转录活性显著低于正常ICSI的胚胎。Wang等[l5] 在小鼠中通过单细胞多组学测序,发现早期圆精子细胞ROSI后胚胎重编程缺陷主要与一组初级合子激活基因(ZGA)异常表达有关,且G9A介导的H3K9me2修饰异常是ROSI胚胎发育效率低下的重要原因[l6-l8] 。近年来关于ROSI的报道相对较少,主要原因是ROSI受精率低、胚胎发育能力差、后代出生率极低[ll,l9]。Hanson等[l9] 对于之前发表的22项研究中的l099对患者和42l8个胚胎移植周期进行Meta分析,结果显示ROSI后卵母细胞的受精率为38.7%[95%CI(3l.5%,46.3%)],移植后胚胎的临床妊娠率为3.7%[95%CI(3.2%,4.4%)],仅有4.3%的胚胎移植后可以正常分娩[95%CI(2.3%,7.7%)],每对患者的妊娠率为l3.4%[95%CI(6.8%,l9.l%)],每对患者活产率仅为8.l%[95%CI(6.l%,l4.4%)]。ROSI效率较低的一个原因可能是没有准确识别圆形精子细胞。圆形精子细胞虽然在睾丸组织悬液中易于与红细胞、白细胞区分,但是由于其他各级生精细胞在形态上与之比较相似,在普通光学显微镜和相差显微镜下难以区分。如果ROSI时注射了其他错误的细胞,甚至是四倍体或者二倍体的精母细胞,并不能使卵母细胞受精和胚胎正常发育[ll,20]。ROSI后的卵母细胞未被完全激活也是ROSI效率低下的另一个原因。虽然Yazawa等[2l] 认为圆形精子细胞激活卵母细胞的能力比较低,但是Tao[22] 发现新鲜的圆形精子细胞注入小鼠卵母细胞内并不能激活卵母细胞。因此,如何准确的挑选出圆形精子细胞并进行合适的卵母细胞人工激活(AOA)是该技术成功的关键[ll,23]。

二、圆形精子细胞的准确识别技术

准确识别圆形精子细胞是ROSI成功的关键性因素。临床上可供ROSI使用的圆形精子细胞必须保证其活性,并且识别时应简单快速。早期通过化学染色法、免疫荧光法、荧光原位杂交技术(FISH)等技术对圆形精子细胞的特点进行了研究,发现人类圆形精子细胞的直径约为6～9μm,与淋巴细胞大小相似,略小于红细胞以及大多数的精原细胞(8～l2μm),细胞核高度浓缩且变小,核质比较低,部分细胞可见顶体囊泡或帽状凸起,没有伪足,FISH检测为单倍体[24] 。由于没有统一的标准,各个研究中心采用的方法大致分为以下几种:

l.普通相差显微镜筛选法:通过Pures Perm密度梯度离心将各级生精细胞分离,圆形精子细胞位于70%以上的分离层中[9,ll],根据圆形精子细胞的形态学特点进行挑选。

2.微分干涉显微镜筛选法:Tanaka等[ll] 通过微分干涉差(DIC)显微镜发现,圆形精子细胞表面光滑,胞浆边缘不明显,没有明显的核仁,用ICSI注射针吸取时极易造成细胞质和细胞核分离。通过Pures Perm密度梯度离心结合DIC显微镜筛选圆形精子细胞,利用FISH和染色体核型分析技术对于筛选出的圆形精子细胞进行验证,准确率达l00%。

3.MitoTracker法:这是一种利用精子的线粒体在圆形精子细胞期开始浓缩并极化等特性,通过MitoTracker染色液对于线粒体特定区域染色,从而筛选圆形精子细胞的一种新兴技术。Sutovsky等[25] 研究发现,由于人类精子线粒体和线粒体DNA在受精后将会被主动降解,浓度低于200nmol/L的MitoTracker染色液对细胞核DNA几乎没有损伤,但是当浓度上升至500nmol/L,则会影响胚胎的发育。200nmol/L MitoTracker染色结合DIC荧光显微镜可以有效识别圆形精子细胞,且有动物实验证明低浓度的MitoTracker并不会引起动物胚胎发育以及后代的异常[26] ,但是对于人类胚胎发育的安全性还未见报道。

4.流式细胞术分选法:Hayama等[27] 开发了一种基于流式细胞术-微流体技术的方法来分离样本中的圆形精子细胞。另一种可用于识别圆形精子细胞的方法是利用单细胞测序技术寻找人类圆形精子细胞潜在的特异性标记物(例如:精子相关抗原6-SPAG6),从而通过流式细胞术快速的识别圆形精子细胞并提高ROSI技术的效率[28] 。

三、ROSI后的AOA

由于圆形精子细胞不具备受精后激活卵母细胞的能力,因此在显微注射之前或者之后对于卵母细胞进行辅助激活是ROSI成功的另一个关键因素。卵母细胞辅助激活的最佳时间为受精卵发生钙离子震荡的时期。有研究发现,钙离子震荡最早发生在ICSI后(l4±6)min,最迟发生在ICSI后(43±20)min[29 ] 。但是,也有研究发现,ICSI后22h内的

激活也同样有效[30] 。因此,卵母细胞的激活机制和激活时间还有待进一步确定。目前,AOA的方式主要有电激活和化学激活。

l.电激活:李子义等[3l] 在小鼠中研究发现,将小鼠的圆形精子细胞注射至经电激活(用含0.05mmol/LCa Cl2和0.l mmol/L Mg SO4的甘露醇作为培养液,l.0KV/cm2直流电脉冲间隔ls激活320μs,激活3次)后的卵母细胞细胞质中,卵母细胞的受精率为35.5%,胚胎卵裂率为28.8%。Tanaka等[23]进一步证明,人类于AOA(用含lmmol/LCaCl2和0.05mmol/LMg Cl2的甘露醇作为培养液,用lMHz5V/cm2的交流电激活l0min,然后用l.2KV/cm2直流电脉冲激活99ms)后l0min行ROSI治疗,能够有效提高其受精率(64.3%vs.32.8%)和卵裂率(55.3%vs.32.7%)。

2.化学激活:多采用不同浓度的乙醇、离子霉素(Ion)、钙离子载体A23l87/GM508(CIA)、氯化锶(Sr Cl2)、6-二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)及放线菌酮(CHX)对ROSI后的卵母细胞进行不同时间的激活。黄静等[32] 在小鼠中研究发现,通过对小鼠ROSI后的卵母细胞进行单一或者联合化学激活,能够有效促进胚胎的发育;l0mmol/LSrCl2作用l.5h,或者7%乙醇联合2mmol/L6-二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)孵育2h对ROSI后的卵母细胞效果最佳,且后者效果优于前者。钙离子载体A23l87也能激活ROSI后的卵母细胞。Rybouchkin等[33]使用5μmol/LA23l87在ROSI后立即激活7min,其激活率为l00%,胚胎发育正常且生育l男婴。Kim等[34] 发现GM508Cult-ActiveCa2+ 激活剂能够改善由于严重男性不育因素而引起的受精失败。卵母细胞在ROSI注射后立即使用GM508激活l5min,能够有效提高卵母细胞的受精率和胚胎的妊娠率。

四、ROSI胚胎发育效率的提高方法

l.甲基转移酶抑制剂的使用:干细胞自我更新因子(DOTl L)能够维持成年期小鼠正常的精子发生,它在人类男性成年后也持续表达。DOTl L蛋白是一种组蛋白甲基转移酶,它可将组蛋白H3的K79甲基化。组蛋白H3K79位点的甲基化修饰在基因的表达调控中起着重要作用,该位点的甲基化修饰通常和转录活化相关。Zhang等[35] 研究发现,H3K79甲基转移酶抑制剂能够有效促进小鼠ROSI后胚胎的发育以及囊胚形成率(53.3%vs.33.7%)。

联合使用组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂和组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂可以显著提高囊胚发育率(66.7%vs.4l.2%),较单用组蛋白H3K9甲基转移酶抑制剂(58.9%)和单用组蛋白H3K79甲基转移酶抑制剂(53.3%)效果更好。

A366是常染色体组蛋白赖氨酸甲基转移酶2(Ehmt2,又称G9A)的抑制剂,它能够抑制Ehmt2修复H3K9me2甲基化状态,从而部分克服早期圆形精子细胞来源的ROSI胚胎重编程缺陷。用A366处理ROSI后的胚胎其受精率与对照组相当,但是囊胚形成率(36.3%vs.l5.8%;P<0.00l)和活产率(l8.7%vs.9.3%;P<0.00l)均显著提升[l5] 。早期精子细胞异常的表观基因组可能影响了ROSI胚胎的发育命运,Ehmt2抑制剂A366处理ROSI胚胎确实可以提高其发育潜能,这与先前的研究结果一致,即降低H3K9甲基化可以提高ROSI胚胎的发育潜力[l5,36]。

2.组蛋白去乙酰化酶抑制剂的使用:Scri Ptaid是一种选择性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,主要用于研究细胞增殖、分化、转录和表观遗传学等领域。它可以通过抑制组蛋白去乙酰化酶的活性,使组蛋白蛋白质的乙酰化水平下降,从而影响基因的转录和表达。Kong等[37] 研究发现,ROSI后的卵母细胞用组蛋白乙酰化酶抑制剂Scri Ptaid250nmol/L处理l0h,与未处理组相比,ROSI后受精卵的囊胚形成率显著提高(59.8%vs.38.2%),并且Oct4、Nanog和Sox2基因在囊胚期的表达均降低至与正常ICSI相似的水平。这可能与Scri Ptaid对于印迹基因控制区中Hl9的异常DNA甲基化进行了修复,使得囊胚中异常甲基化状态的多能性相关基因异常也恢复正常,从而恢复了ROSI后胚胎的发育潜能。Tanaka[38] 也试图通过Scri Ptaid在人类中来解决ROSI后表观遗传错误(染色质重塑/组蛋白修饰不完全、DNA去甲基化活跃)等问题,虽然Scri Ptaid在小鼠中可以显著提高ROSI后胚胎的发育潜能,但是在人类ROSI中效果还未被证实。

五、总结与展望

ROSI技术从提出到现在已经过去了将近30年,但是相关研究还是鲜有报道。虽然ROSI的活产率极低,但是现今为止依然是NOA患者获得其遗产学后代的重要途径。通过ROSI技术已经有近百名孩子出生,这些孩子随访发育状态良好,身体状况和心理健康均与正常生育孩子并无明显区别[ll,23]。但是由于样本量依然很少,并不能完全确认ROSI技术的安全性。相信在不久的将来,随着国内外对于ROSI技术的进一步研究,我们能够发现更多圆形精子细胞的特征,并且利用特殊显微镜和计算机辅助等方法能够进一步提高优质可用圆形精子的识别率,筛选出最佳的激活方法,结合植入前基因检测(PGT)技术等措施,提高ROSI的成功率,为NOA患者带来真正的福音。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突。

作者贡献 李波负责文献搜索、论文撰写及修改;杨喆东负责文献搜索及分析;师娟子负责研究指导、文章审阅、经费支持。

参考文献略。

来源：生殖医学杂志2025年5月第34卷第5期

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