作者：昆明医科大学第三附属医院骨科     李涛

骨肉瘤(OS)是一种相对罕见但恶性程度较高的原发骨肿瘤，具有高度侵袭性和转移倾向，尤其是肺部转移，全世界的发病率为3/100万，占原发骨肿瘤的11.7%。OS主要发生在儿童和青少年的长骨干骺端，特别是股骨远端、胫骨和肱骨近端。目前，OS的治疗主要以手术和辅助化疗为主。在此模式的综合治疗下，局限期患者5年生存率约为70%，但复发转移患者5年生存率仅20%左右，治疗效果极差。面对无法手术，且对化疗药物不敏感或不耐受的OS患者，现有的治疗技术仍然有限。然而，随着分子分析技术的不断进展，可以寻找靶向药物来提高生存率。Krüppel样因子(KLF)是一组进化上保守的锌指转录调节因子，是DNA结合转录必不可少的调节因子。其可结合多种特定蛋白质以介导转录调控并参与许多生物学功能，如细胞分化、增殖、细胞凋亡、代谢和发育。KLF最初被发现是黑腹果蝇胚胎分割和突变的关键发育基因。

1993年，首次在红细胞中发现了第一个哺乳动物KLF，也称为红细胞Krüppel样因子(EKLF/KLF1)。人类基因组包含了17个KLF基因(KLF1-KLF17)，每个基因都有独特的组织分布模式和功能，这些基因是根据顺序命名的。KLFs的所有亚型在其羧基末端都具有3个高度保守的Cys2His2型锌指基序，并且每个锌指结构具有固定的长度，锌指结构1和锌指结构2均具有23个氨基酸残基，锌指结构3具有21个氨基酸残基(图1)。在KLF的碳末端区域，3个保守的锌指基序通过与GC盒中富集的DNA序列结合或靶基因中的碱基CACCC同源性来表达转录抑制或激活。与羧基末端区域不同，KLF的氮末端区域通常介导蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用。此外，非DNA结合区/氮末端区具有特异性，具有反式激活、激活和阻遏结构域，它们通过与不同的共激活因子、共抑制因子、修饰因子和其它特定转录因子结合而表现出功能变异性和多样性。已有研究表明，许多癌症都与KLFs有关，如结直肠癌、肺癌、乳腺癌等。作为转录因子，KLFs可以通过调节癌细胞的增殖与凋亡、转移、肿瘤微环境以及癌症干细胞的干性参与癌症形成。在许多癌症类型中，KLFs的表达水平发生改变。不同KLF蛋白在癌症中发挥的功能也不尽相同。因此，了解KLF在癌症中的作用机制可以为癌症的诊断治疗和药物开发带来新的发现。本综述主要总结KLF家族与OS的关系，希望能为OS的临床治疗提供更多思路。。

KLFs在OS中的表达及影响

KLF家族在OS的发生、发展过程中扮演着重要角色。不同成员的KLF蛋白可通过多种机制影响OS细胞的生物学行为，比如调节细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移能力和癌细胞干性等。在OS中发挥功能的主要KLF基因包括：KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9和KLF11。这些KLF家族蛋白在OS中的功能以及参与调控的信号通路见表1。

1.KFL2与OS：KLF2在各种恶性肿瘤中通常低表达，能通过促凋亡和抗血管生成作用抑制肿瘤生长，被认为是一种抑癌基因。KLF2是一种与细胞周期相关的基因，通过诱导GO/G1期细胞周期停滞并导致细胞凋亡来抑制OS细胞增殖。有研究发现降低KLF2的表达可提高U2OS细胞(人OS细胞)的细胞活力，相反，KLF2的高表达能通过激活抑癌基因p15和p21发挥促凋亡作用并抑制增殖。KLF2也可通过zeste增强子2(EZH2)的多梳组蛋白增强子介导的转录抑制，从而降低KLF2在OS细胞中的表达。环状RNACircLRP6也被证明可以通过抑制KLF2来促进OS的进展。circLRP6下调可诱导细胞凋亡，并在G0/G1期使OS细胞周期停滞。circLRP6与组蛋白去甲基化酶-1(LSD1)和EZH2之间的相互作用介导它们与KLF2的启动子区域的结合，从而调控KLF2的表达。还有研究表明KLF2和小核仁RNA宿主基因6(SNHG6)呈负相关关系，SNHG6下调可诱导KLF2高表达，从而抑制了OS细胞增殖的过程，促进了OS细胞的凋亡。

2.KFL3与OS：与KLF2类似，KLF3通过影响细胞周期来抑制肿瘤生长。有研究发现KLF3的mRNA和蛋白水平在OS细胞和组织中升高，并与肿瘤大小、转移和TNM分期以及OS患者的不良预后显著相关。但KLF3仅在人软组织肉瘤和OS组织中弱表达。KLF3的过表达可上调OS细胞中的p21，并抵消RNA去甲基化酶(FTO)介导的细胞周期蛋白D1表达的升高，从而阻止OS细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡。Chen等的研究发现下调KLF3-AS的表达可在体外诱导OS细胞的凋亡，抑制细胞增殖并减少体内肿瘤生长。并且MiR-338-3p可下调KLF3-AS1的表达，从而减弱对OS细胞生长的抑制作用。

3.KFL4与OS：KLF4是KLF家族中被报道最多有争议的转录因子，有关报道，有近一半与癌症相关。在大多数肿瘤类型中，KLF4起到抑制肿瘤进展的功能，被认为是一个抑癌基因，然而在少数肿瘤类型中，比如乳腺癌和胶质母细胞瘤，其又起到原癌基因的作用。KLF4在OS中的功能也存在争议。目前，KLF4主要被认为在OS中发挥原癌基因的作用，它可以通过抑制细胞凋亡和促进增殖、迁移和侵袭来推动OS的进展。早在2015年就有人指出，KLF4的高表达与OS患者较差的总生存率和较差的无转移生存率有关，这就表明了KLF4可以促进OS细胞的生长。OS癌症干细胞(OSCs)具有自我更新、多能、致瘤性、多重耐药性和转移性等特点。OSCs的存在是治疗失败的主要原因之一。使用阿霉素治疗OS会引起化疗耐药，这是由于OS细胞的干性表型增强。研究发现，经阿霉素治疗后产生化疗耐药的OS患者，体内KLF4的表达水平会升高。KLF4高水平表达会增加OS中癌症干性的比例，并可以明显增加OS细胞中癌症转移相关标志物CXCR-4在mRNA和蛋白质水平上的表达，从而促进OS细胞的迁移。研究还发现p38MAPK可能是KLF4介导OSC相关功能的关键下游靶点，KLF4-p38MAPK轴确定为OS治疗的潜在治疗靶点。另外，Wang等的研究证明，KLF4泛素化的减少使其稳定存在于人类OS细胞中，并有助于OS的进展。KLF4还直接与其下游基因层黏连蛋白亚基因α4(LAMA4)的启动子结合，以促进其转录，从而抑制OS细胞的凋亡并促进肿瘤的发生和迁移。另一项研究发现KLF4在LncRNASOX21-AS1增强人类OS细胞增殖的过程中上调，而人参皂苷Rg3通过靶向下调KLF4来降低OS细胞增殖。

然而Wang等也发现miR-10b可以通过下调KLF4来促进OS细胞的侵袭、增殖。KLF4在OS中的不同功能可能与ncRNA庞大而复杂的基因调控网络有关，ncRNAs可以调节许多原癌基因和抑癌基因的表达。目前尚不清楚其它未被发现的潜在分子是否会干扰KLF4的功能。同时，一些关键的原癌基因和抑癌基因经常发生突变，如GATA3、Kras或p53，这也可能决定KLF4在疾病中作用的转变。

KFL5与OS：KLF5在OS组织中的表达往往高于正常组织，被认为是原癌基因。KLF5通过直接结合miR-487a的启动子区域来增强miR-487a的表达，KLF5/miR-487a信号转导通过靶向下调NK3同源框1来促进OS细胞的侵袭和转移。这表明KLF5通过直接调控microRNA来促进OS。此外，其还可以通过激活JAK2/STAT3和WNT/beta-catenin信号通路影响OS的发生进展。当使用KLF5的抑制剂ML264对细胞进行处理，可以达到抑制细胞增殖、迁移和侵袭的能力。

KFL6、7、8与OS：KLF6被认为是多种肿瘤中的抑癌基因，KLF6可以通过影响细胞周期来抑制OS。有研究发现KLF6的过表达上调了MG-63细胞(人OS细胞)中p21的表达水平，同时降低了bcl-2和基质金属蛋白9(MMP-9)的表达水平。而抑制KLF6的表达可促进MG-63细胞的存活、增殖和侵袭。KLF6也是ncRNA(circMTO1和miR-630)的下游靶标，它可以抑制OS细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。KLF7在OS组织和细胞系中高表达，LncRNAKCNQ1OT1可以通过靶向miR-3666/KLF7轴来促进OS进展并激活Wnt/β-catenin信号转导，Wnt/β-catenin信号转导通路已被证明在癌症的发展和进展中起着关键作用。KLF8在OS组织中高度表达，并在CD133阳性癌症干细胞(CSC)群中高度富集。KLF8通过下调miR-429激活Sox2转录，从而增强CSC的干性。其它研究也证实了KLF8的致癌作用，KLF8通过参与上皮-间充质转化(EMT)过程和增加化疗耐药性来影响OS细胞增殖、迁移和侵袭。但是也有研究表明KLF8可被miRNA-1236-3p下调，抑制OS细胞增殖并诱导细胞凋亡。

KFL9与OS：KLF9被认为是一种抑癌基因，参与调节OS的恶性进展。KLF9也是ncRNA(circMTO1和miR-630)的下游靶标，KLF9作为circ_0078767的下游靶点被上调，从而抑制OS细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT，促进OS细胞凋亡。同样，miR-652通过下调KLF9以促进OS细胞增殖和侵袭。更重要的是，KLF9可以在ncRNA的下游进行调控并直接影响miRNA的表达。例如，KLF9作为miR-338-3p的上游调节分子，直接增强miR-338-3p的活性和表达，对OS细胞的增殖、迁移和侵袭起抑制作用。有研究还表明miR-378在人类OS组织和细胞系中高度表达。miR-378的过表达显著促进OS细胞增殖。作为miR-378下游的功能靶标，KLF9的高表达可以抑制miR-378对OS细胞增殖的启动子作用。因此，KLFs和ncRNAs在OS进程中的关系值得进一步探索。

KFL11与OS：KLF11在OS患者中低表达。有学者通过全基因组CRISPR-Cas9筛选将KLF11确定为OSCs的关键负调节因子，并发现其参与调节Yes相关蛋白(YAP)的转录活性。KLF11的低表达与OS患者的不良预后和化疗反应较差相关，可以作为OS患者化疗反应的独立预测因子。另有研究发现KLF11显著下调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的组织因子基因转录，而组织因子已被证实参与OS细胞的增殖和迁移，这可能也是KLF11调节骨肉瘤的机制之一。

KLFs介导的靶向治疗

由于OS的基因组高度不稳定性和高异质性，目前没有可行的治疗方法。KLF家族在OS的发生和进展上发挥重要功能，在OS患者中，KLF的蛋白水平通常发生变化。因此在临床上，可以通过促进或抑制KLFs的表达来调节OS进展。基于KLFs的调控差异，临床上治疗OS的药物可以分为以下3类：(1)已知能直接调控KLFs在肿瘤细胞中表达的药物，如辛伐他汀、顺铂和吗啡、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、ML264等；(2)间接影响KLF表达的药物，如唑来膦酸；(3)靶向药物，如抗miRNA，专门设计用于靶向特定核酸序列。

辛伐他汀：有研究表明，他汀类药物可抑制KLF4蛋白表达水平，进而影响OSsphere形成能力。多个他汀类药物均能浓度依赖性地降低KLF4蛋白的表达，其中辛伐他汀的作用最强。辛伐他汀是一种降胆固醇药物，具有抗癌潜力。除了KLF4以外，辛伐他汀可以诱导KLF2的表达和抑制甲羟戊酸途径。Lu等发现，甲羟戊酸通路可以降低KLF2的mRNA水平，阻止甲羟戊酸通路的抑制作用有利于KLF2的表达。作为HMG-CoA还原酶抑制剂，辛伐他汀通过甲羟戊酸途径抑制HMG-CoA还原酶，可有效减少许多恶性肿瘤的生长，包括黑色素瘤、神经胶质瘤、肝细胞癌和乳腺癌等。有研究显示，辛伐他汀具有剂量和时间依赖性来抑制OS细胞生长和诱导细胞凋亡的潜力。

吗啡：吗啡是一种阿片类药物，通过抑制突触前膜神经递质的释放来缓解癌症疼痛，尤其是在癌症晚期。Suzuki等已经证明吗啡可以上调KLF7的表达，KLF7在mRNA和蛋白质水平上都是一种致癌基因。这表明吗啡有促进肿瘤进展和血管生成的副作用。吗啡与低剂量阿片类拮抗剂纳洛酮联合使用时，可以增加吗啡的治疗效果。纳洛酮还可以通过与吗啡竞争受体来抑制KLF7的表达。因此吗啡和低剂量纳洛酮组合治疗癌症可能更加有效。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ可诱导KLF11的表达，噻唑烷二酮类(TZDs)是一种刺激KLF11的过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂，可能会成为阻断OSCs的有效药物。因此，通过KLF11靶向OSCs治疗OS是一种可行途径。

ML264：ML264是一种KLF5的小分子抑制剂，在结直肠癌中具有抗增殖作用，可在G0/G1期诱导细胞周期停止并抑制OS细胞迁移、侵袭和肿瘤微环境，相关研究证明了ML264可以作为OS的新型靶向药物。

顺铂：顺铂是广泛用于化疗的抗癌剂，通过干扰DNA修复机制诱导肿瘤细胞死亡。然而，化疗耐药性很容易影响修复受损DNA的过程。顺铂可以增加乳腺癌细胞中KLF2的mRNA水平，同时，KLF2也可以通过下调WEE1信号通路来增强顺铂的治疗效果。WEE1的功能与顺铂治疗的化疗耐药性有关，它通过修复G2/M检查点的受损DNA，G2/M检查点是癌细胞修复的主要检查点。作为一种抗癌药，顺铂可以通过上调KLF2表达来显著提高治疗效果，以抵消WEE1的负面影响。此外，顺铂与其它药物(如紫杉醇、替加氟尿嘧啶、多柔比星、吉西他滨、维生素D等药物)联合使用也可以抑制化疗耐药。

唑来膦酸(ZA)：ZA属于双膦酸盐的一种，已被证明在体外和体内对骨质疏松症和肿瘤发生抑制有着显著作用。在体外，ZA通过上调KLF2和KLF6的表达来抑制MCF-7乳腺癌细胞系。Benzeno等证明，KLF6可以通过与CyclinD1结合来破坏G1/M检查点来抑制肿瘤细胞的生长，这表明ZA与肿瘤调节之间存在很强的关联。ZA可以抑制甲羟戊酸途径的关键酶法呢基焦磷酸合酶。由于KLF2已被证明可以通过甲羟戊酸途径抑制，因此应用ZA可以通过抑制甲羟戊酸来增加KLF2的表达。有学者建议将先导药物和他汀类药物联合使用可增加抗癌效果。然而，在体内，由于复杂的肿瘤微环境，ZA对抑制破骨细胞的治疗效果大于抗肿瘤功能。

抗miR：在OS的发生和发展过程中，KLF蛋白通过调控ncRNA，或作为ncRNA的下游靶点发挥重要作用。特异性抗miR已被用作抑制癌细胞的靶向药物。抗miR属于一种人工核酸序列，它与具有互补碱基对的miRNA结合，可以阻断miRNA的负面影响。但抗miR不能通过黏膜屏障和血脑屏障，因此纳米颗粒被用作将抗miR转移到靶向miRNA的递送工具。

总结与展望

综上所述，OS具有高度侵袭性和转移性，其发生发展涉及多种突变基因、多条信号通路。由于KLFs可以直接或间接控制OS细胞的生长、迁移、侵袭和转移，靶向KLFs通路可能成为OS的潜在治疗策略。随着人们对KLFs的理解不断加深，目前已经发现了部分癌症治疗的药物可以调控KLFs药物，但由于OS的发病率低，所涉及的信号通路众多，仍需要更多的大样本临床研究来证实这些药物的效果。研究者也需要对KLFs的结构、功能和信号通路以及在OS发展中的作用机制进一步探索，继续研究更多的靶向药物，并评估其有效性和安全性。相信，随着测序以及基因编辑技术的发展，未来可以开展以生物标志物为基础的临床试验，使靶向KLF治疗OS的疗效最大化，从而引领OS进入“精准化”治疗时代。

来源：中国骨与关节杂志2025年2月第14卷第2期

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