作者：南京大学医学院附属金陵医院骨科     端嘉骅

骨组织具有一定的再生能力，较小的损伤可以自然愈合，但骨缺损超过临界阈值(通常为2cm)被称为大段骨缺损，将无法自然愈合。大段骨缺损的概念由Schmitz等在1986年首次提出，其研究表明在无外界干预的条件下，骨缺损存在一个无法自愈的临界值。2015年，Mauffrey等将大段骨缺损定义为缺损尺寸>2cm或超过骨周径50%的骨缺损。创伤、退行性疾病、先天性缺陷和肿瘤切除均可导致大段骨缺损，如果要实现骨组织完全愈合和功能恢复，则需要临床干预。对于患者和骨科医师来说，大段骨缺损的重建一直是一个巨大的挑战。目前，自体骨移植是治疗大段骨缺损的“金标准”，然而自体骨移植具有诸多缺点，如骨来源有限、尺寸不匹配和供体部位损伤等。临床上大段骨缺损修复的其它方法如同种异体骨移植也有缺点，如疾病传播、污染和免疫排斥等。骨组织工程技术给大段骨缺损修复带来了新的希望，近年来受到了越来越多的关注，成为研究热点。骨组织工程包括支架、种子细胞和生长因子3个要点，生物材料支架一般作为引导和支持组织形成的基础，同时传递细胞和生物活性因子促进骨再生。由于对骨组织的成骨机制和骨结构认知和理解不足，骨组织工程对大段骨缺损的治疗，仍处于研究阶段，离实际临床应用仍有距离。笔者对骨组织的成骨机制和骨结构展开综述，为后续骨组织工程生物材料设计提供帮助和灵感。

骨发生与骨再生机制

骨发生：在胚胎发育过程中，颅神经嵴细胞形成颅面骨，轴旁中胚层细胞主要形成轴骨(如脊柱)，侧板中胚层细胞形成四肢骨。神经嵴和轴旁中胚层来源的间充质干细胞会发生膜内成骨和软骨内成骨两条成骨途径。近年来，更多间充质干细胞表面的特异性标记物被发现。间充质干细胞通常会表达表面标记物CD73、CD90和CD105，但不表达CD45、CD34、CD14和CD79，此外表达PDPN+CD146+CD73+CD164+的间充质干细胞分化成为骨祖细胞和软骨祖细胞，这些祖细胞最终分化为骨、软骨和基质。骨发生包括膜内成骨和软骨内成骨两条途径。膜内成骨发生在少数区域，主要是扁平骨，如下颅骨、颌骨、锁骨。大多数骨骼包括胚胎中的长骨和轴骨，都是通过软骨内成骨形成的。在膜内成骨中，间充质干细胞首先聚集，然后中间的间充质干细胞分化为表达RUNX2和Osterix(OSX)的骨祖细胞，随后这些骨祖细胞又分化为成骨细胞。成骨细胞会分泌一种富含Ⅰ型胶原(COL1)的基质，并分泌细胞外基质蛋白，包括骨钙素(OCN)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)和转化生长因子-β(TGF-β)。磷酸钙随后沉积在细胞外基质上，形成矿化的骨组织。在膜内成骨过程中，未分化的间充质细胞留在骨周围形成骨膜。骨膜将通过产生新的成骨细胞来推动骨组织的进一步生长。

在软骨内成骨中，间充质干细胞会发生凝聚，凝聚中心的细胞分化为表达SOX9的软骨细胞，这些软骨细胞会分泌一种富含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的基质。凝聚边缘的间充质细胞会形成软骨膜包裹软骨。软骨通过软骨细胞增殖和软骨基质的生成而增大。凝聚中心的软骨细胞到一定阶段会停止增殖，转而体积变大成为肥大软骨细胞，肥大软骨细胞会表达血管内皮生长因子(VEGF)及X型胶原、碱性磷酸酶(ALP)等因子。VEGF促进了血管的长入，肥大软骨细胞还能引导邻近的软骨膜细胞变成成骨细胞，成骨细胞随血管侵入凝聚中心。此外有研究表明跟随血管侵入凝聚中心的是表达OSX的成骨细胞前体，而表达COL1的成熟成骨细胞则留在发育中骨的外周，进而形成初级骨化中心。在初级骨化中心内，肥大软骨细胞凋亡吸引破骨细胞，破骨细胞会降解软骨基质，成骨细胞形成骨小梁替代消失的软骨基质，进而形成骨髓。软骨基质的降解和肥大软骨细胞的作用是血管侵入和骨化开始的关键步骤。有研究表明软骨基质降解是由表达脂肪酸结合蛋白5的间隔细胞(septoclast)介导的，间隔细胞具有多种分泌蛋白酶和控制细胞外基质降解的基因。与此同时，软骨膜中的成骨细胞形成骨领(bonecollar)，即骨皮质，从而将软骨膜转化为骨膜。在软骨组织的一端或两端，一部分软骨细胞呈扁平的盘状，堆叠形成柱体结构，这些软骨细胞具有明确方向，引导骨沿着一个方向生长。这部分软骨被称为生长板，也被称为次级骨化中心。在生长板顶部的软骨细胞不再快速增殖，称为静息或储备软骨细胞，但在特定条件下会变成增殖的软骨细胞。软骨细胞的增殖决定了骨的纵向生长，沉积的基质为未来的骨形成提供了支持。在人体中，生长板在青春期后消失。骨发生的信号通路很多都尚不清楚，目前已经被证明的信号通路包括Ihh/PTHrP、成纤维细胞生长因子(FGF)、BMP和Wnt信号通路。Wnt信号通路在骨发生过程中起到关键作用，通过调控成骨细胞、骨细胞和破骨细胞的功能，调控骨发育和维持骨的稳态。

骨再生：骨是为数不多能够愈合且不形成纤维性疤痕的组织。骨再生的过程在很大程度上与骨发生相同，但因炎症和机械负荷的存在而略有不同。骨再生主要有两种机制，即膜内成骨和软骨内成骨，后者在骨再生中起主要作用。稳定型骨折，即骨折两端紧密相对且机械应力稳定、不易发生移位的骨折通过膜内成骨愈合，部分稳定或不稳定型骨折主要通过软骨内骨化愈合。

骨再生过程包括4个不同的阶段：(1)最初的炎症反应和骨祖细胞的募集；(2)软骨性骨痂的形成；(3)松质骨的形成；(4)未成熟骨重塑为成熟的板层骨。骨外伤后由于血管破裂立即产生血肿，血肿由来自外周血和周围组织的免疫细胞组成。其中巨噬细胞释放促炎细胞因子，而中性粒细胞促进间充质干细胞迁移到损伤部位。在炎症反应期，肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1(IL1)、IL6等趋化因子和炎性细胞因子被分泌从而募集炎性细胞，血肿中的血小板和炎症细胞释放多种生长因子，包括TGF-β、BMP、FGF和血小板源生生长因子(PDGF)，促进骨膜内骨祖细胞的活化和增殖。炎症反应消退后，间充质干细胞在骨折部位周围聚集形成肉芽组织。这些间充质干细胞向软骨细胞分化，参与软骨基质的形成，间充质干细胞还会向成骨细胞分化，促进骨折边缘的膜内成骨。在骨折愈合的最后阶段，通过破骨细胞和成骨细胞的共同作用，成熟的板层骨取代编织骨，逐渐恢复原始骨形状和骨髓腔的重建。

血管再生：在骨修复过程中，血管系统提供营养物质如氧气、葡萄糖、氨基酸和脂质，生长因子和细胞。骨修复延迟或不愈合与损伤部位血液供应减少和营养物质供应缺乏有明确关系，这表明血管再生在骨修复过程中起重要作用。血管再生，即新血管网络的形成，是伤口愈合的重要过程，在内皮细胞迁移、增殖以及随后分化为成熟血管的过程中，受到细胞外基质、细胞和生长因子的调控。骨折部位缺氧会诱导VEGF等血管生成因子的产生，刺激血管再生。此外，FGF-2在体内可促进血管生成，在体外可促进内皮细胞增殖、趋化和血管形成。FGF-2还通过自分泌和旁分泌机制诱导内皮细胞中VEGF的表达。有研究发现DJ-1/PARK7是在成骨分化过程中由人间充质干细胞(hMSCs)分泌的一种新型血管生成因子。DJ-1通过激活FGFR-1信号通路促进成骨和诱导血管形成。骨修复过程中，成骨成血管偶联机制起到关键作用，血管可以提供旁分泌信号，协调促进间充质干细胞的迁移和成骨分化。有研究表明，间充质干细胞在靠近血管处增殖和分化为成骨细胞从而促进骨组织再生。此外，起源于骨膜和髓腔内血管的新生毛细血管与间充质干细胞协同侵入无血管的骨痂组织，从而促进骨痂重塑和软骨内骨化。再生的骨组织也会进一步导致血管的再生和重塑。

骨结构

密质骨和松质骨：骨组织由密质骨和松质骨两个部分组成，密质骨分布于骨组织的外侧面，松质骨分布于骨组织的内侧。机械支持主要由密质骨提供，密质骨是一种致密的固体组织，排列紧凑，形成骨的外壁。松质骨是一种较轻、密度较低的骨，存在于骨内高度血管化的部分。密质骨的抗拉强度(3.1～180.0GPa)和抗拉模量(3.9～71.0GPa)比松质骨大2～3个数量级。松质骨的抗压性能因体内位置不同而有很大差异，但密质骨的抗压强度(130～180MPa)和抗压模量(4.9～34.0GPa)也显著大于松质骨。密质骨的骨板紧密结合，排列规律，按排列方式可分为环骨板、骨单位、间骨板。松质骨则由相互连接的骨小梁组成，骨小梁也是由几层平行排列的骨板构成。骨板是由胶原纤维和磷酸钙晶体组成。胶原纤维长度可达1cm，直径可达1µm。骨的胶原纤维主要由Ⅰ型胶原蛋白组成，胶原蛋白分子内部通过分子间共价键广泛交联，分子间的空隙较大，利于磷酸钙晶体沉积。胶原蛋白分子是由2条α1链和1条α2链组成的异源三聚体分子，胶原蛋白分子的长度约为300nm，宽度约为1.5nm。胶原纤维的排列方式分为有序和无序两种，在有序排列中，胶原纤维围绕一个轴紧密排列形成纤维束，其直径通常为1～3µm。单个骨板层在三维空间中常表现为一层纤维束并排排列，而相邻骨板层的胶原纤维的方向不同。相邻的骨板间被无序排列的胶原纤维分开，其方向不定。骨细胞主要在无序排列的胶原纤维中。

骨的无机质和有机质：骨无机质的主要部分为羟基磷灰石。在纳米水平上，针状矿物晶体横向合并形成薄片层，薄片层大致平行堆积，相邻层之间间隔约为2nm。相邻薄片层之间含有混乱排列的磷酸钙、水，非胶原蛋白和多糖，这些针状和薄片层晶体堆叠在一起，形成更大的多晶体，跨越相邻的胶原纤维。目前对骨结构的理解是，有机和无机成分在亚微米水平上混合，产生矿化的胶原纤维。骨的有机基质主要是胶原纤维，其它有机基质包括蛋白聚糖和非胶原蛋白。非胶原蛋白约占骨有机基质的10%～15%。由于丰富的酸性氨基酸苏氨酸和丝氨酸残基的磷酸化，非胶原蛋白通常带高度负电荷。非胶原蛋白如骨唾液酸蛋白(BSP)、OCN在体内骨矿化过程中起关键作用。在成骨细胞分泌有机胶原基质后，无机的羟基磷灰石沉积在胶原纤维内部和周围。在胶原蛋白模板内部或周围形成无机矿物质的过程被称为胶原蛋白矿化。大部分骨矿物质沉积在胶原纤维外周，少部分沉积在胶原纤维内部。胶原分子的有序排列为羟基磷灰石的定向形成提供了模板。

骨组织工程技术

如今，生物活性材料制备与合成的进步，以及对骨组织生物学和结构理解的提高，为设计更复杂的骨组织工程复合材料提供了新的可能。生物活性材料旨在模仿骨组织的细胞、蛋白质和矿物质成分的结构和功能，从而促进和支持新骨组织的生长并恢复其功能。骨的多级结构及其在胚胎发育和骨折愈合过程中的自然形成过程为骨组织工程的新方法提供了灵感，大量的新型材料如陶瓷、高分子聚合物等被开发和利用于骨组织工程。

生物材料通过模仿细胞外基质，可以为骨组织的生长提供合适的微环境，加速细胞迁移，促进成骨分化。近年来由纳米纤维、纳米管、纳米颗粒和水凝胶制成的支架材料具有广阔的前景，可以模仿天然细胞外基质的纳米结构，从而有效替代缺损组织。纳米结构对于调节细胞功能，如增殖、迁移、分化和细胞外基质的形成有至关重要的作用。通过模仿生理骨结构，Liu等利用非胶原蛋白类似物聚丙烯酸在体外制作出矿化胶原支架，矿化发生在胶原纤维内部与生理骨类似，形成层级结构具有与骨相似的抗压强度，体外实验表明该支架促进了间充质干细胞成骨分化，该支架具有合适的降解速率，为新骨生产提供空间，体内实验结果表明该支架显著促进了骨再生。血管化在骨再生中起至关重要的作用，有研究报道，支架的管状结构不仅可以促进氧气和营养物质的输送，还可以促进组织血管化。Duan等通过3D打印相分离技术模仿血管结构制作出血管仿生支架，该支架具有良好的生物相容性，促进了间充质干细胞成骨分化，在兔股骨缺损模型中，血管仿生支架显著促进了骨缺损中血管的再生和骨再生。

生物活性因子重组蛋白、核酸、小分子药物等，具有调节细胞增殖、迁移和分化的功能，在骨组织再生中起重要作用。生物活性材料除结构设计外，还需要生物活性因子来加速骨再生，因此基于生物活性材料的递送药物系统具有广阔的前景。优秀的递送系统可以缓释药物从而增强药效和药物稳定性，这样可以提升药物的整体疗效。Ha等使用3D打印技术制作出血管仿生支架，将包封促进血管再生的小分子药物二甲基草酰甘氨酸(DMOG)的介孔二氧化硅分布在支架表面，而将包封促进的成骨分化多肽的介孔二氧化硅分布在支架内部，这样制作出了一个双重递药系统。该系统可以实现促血管药物的快速释放、促进成骨药物的缓慢释放，细胞实验表明，该双重递药支架可以促进血管生成和成骨分化。此外，通过皮下和颅骨缺损模型证实了该系统可以同时促进血管再生和骨组织再生。骨组织的修复和再生过程受多种生长因子的调控，但重组蛋白在体内半衰期短，易被降解，因此重组蛋白在骨修复领域的应用需要合适的递送系统。Briquez等使用蛋白质工程技术制备出融合蛋白FabCol-LamLG4，该融合蛋白同时对BMP-2和胶原具有高亲和力，从而使BMP-2吸附在由胶原制成的支架表面，实现对BMP-2的缓释。体外和体内实验证明该复合支架对于骨再生具有显著的促进作用。

总结与展望

近年来，骨组织工程领域取得了巨大进步，骨组织工程已发展成为生物工程、材料科学、药理学、医学和生命科学等多个领域相结合的交叉学科。成骨机制和骨组织结构的研究大力推动了骨组织工程的发展。生物活性材料可以模拟骨细胞外基质中存在的独特微环境信号，提供结构、机械和生物信号来指引间充质干细胞的存活、增殖和分化。但目前成骨机制和骨组织结构仍有很多疑问尚未得到解决，生物活性材料也无法完全模拟骨组织结构，其提供的活性成分有效性和安全性还需进一步验证，骨组织工程距离实际临床应用仍有一段距离。目前还需要解决一些关键问题有：羟基磷灰石在胶原纤维上如何结晶矿化，间充质干细胞在体内复杂环境如何增殖迁移和分化，生物活性材料的制备技术还需进一步提升等。成骨机制和骨组织结构的研究进展为骨组织工程提供理论基础，为研制出效果更好，安全性更佳，更符合骨生理结构的生物活性材料铺平道路。

来源：中国骨与关节杂志2024年12月第13卷第12期

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