作者：王菁，徐文华，安徽医科大学附属口腔医院口腔颌面外科
外泌体是一种直径为30～150 nm的细胞外囊泡(extracellular vesicle， EVs)，由细胞质膜向内出芽产生的早期核内体逐渐演化，在聚集形成多囊体后通过与细胞膜的融合形成了外泌体这一具有脂双层结构的小泡，因其内包裹有核酸、蛋白质等细胞内物质，而在细胞间的物质运输及细胞间通讯的信号传递中发挥着重要作用。
随着对外泌体研究的深入，人们发现外泌体可由哺乳动物体内大多数细胞产生并广泛分布于唾液、血液、尿液等多种体液中。外泌体具有完整的磷脂双分子层结构，能够通过内吞作用转运DNA片段、非编码RNA、mRNA、蛋白质等多种分子参与细胞间通讯，通过介导细胞通讯和旁分泌等机制参与多种生理过程和包括肿瘤疾病在内的疾病发展过程。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一种长度为18～25 nt的短链非编码RNA，通过与其靶向的mRNA的3'端非编码区结合引起基因沉默，将mRNA降解或者阻断其靶基因转录的过程而参与基因调控。在口腔
作为一种生物小分子，miRNA在细胞外的肿瘤微环境和体液循环中难以稳定存在，而外泌体作为一种磷脂双分子层组成的小泡，能够在miRNA转运过程中为其提供稳定的载体。因此，外泌体miRNA作为一种能够准确靶向mRNA并对OSCC进行调控的稳定性因子，研究其在肿瘤发生发展过程中的具体机制并探索其在OSCC的临床诊断与治疗中的实用价值具有重要意义。
1. 外泌体miRNA在OSCC中的作用机制
外泌体作为运输载体能够将miRNA运送到相应的靶细胞通过影响靶细胞内的信号通路对OSCC发生发展过程进行调控。这种信号的传递不仅限于肿瘤细胞之间，同时也存在于肿瘤微环境中的各类非肿瘤细胞间。不同细胞衍生的外泌体内包括miRNA在内的核酸、蛋白质等生物活性物质的种类和含量均有显著差异，对于OSCC进展过程的影响也不尽相同。
1.1 外泌体miRNA在OSCC细胞之间通讯的作用
肿瘤细胞衍生的外泌体中miRNA含量与正常细胞相比通常发生变化，这些外泌体被其他肿瘤细胞内化后，会引起肿瘤细胞内相应的信号通路发生改变，进而促进肿瘤增殖、迁移、侵袭等恶性表型。人OSCC细胞系HOC313-LM具有高度迁移能力，有研究表明该细胞系衍生的外泌体中miR-342-3p和miR-1246高表达，外泌体能够将这两种促癌因子转移到迁移能力较为低下的癌症细胞系HOC313-P中，增加肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。
有文献报道了OSCC细胞系HN-4和HN-6衍生的外泌体中miR-185-3p含量丰富，进一步研究发现亲代肿瘤细胞衍生的外泌体miR-185-3p能够转移进入其他肿瘤细胞中，并通过靶向RAB25促进肿瘤细胞的增殖和集落形成。
1.2 外泌体miRNA在肿瘤细胞与肿瘤微环境相关细胞之间通讯作用
除了肿瘤细胞自身相关信号通路的改变所引起的肿瘤恶性进展，肿瘤微环境(tumor microenvironment， TME)在肿瘤的发生发展过程中也具有极为重要的作用。TME由肿瘤细胞和包括成纤维细胞、血管生成相关的细胞以及免疫相关细胞在内的多种非肿瘤细胞及其分泌的各种信号分子和细胞外基质所组成，这些细胞及其产生的信号分子与肿瘤细胞相互作用，共同促进肿瘤的发生发展。
1.2.1 肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associatecl fibrobbasts， CAFs)
CAFs主要是由来源于间充质干细胞的正常成纤维细胞转化而来，是肿瘤微环境中的主要组成部分之一。CAFs能够产生细胞因子、生长因子等各类物质，作用于周围环境中的细胞。在这个过程中，外泌体在CAFs与周围细胞之间的细胞通讯过程发挥着不可忽视的作用。
miR-34a-5p被证明在肿瘤微环境中CAFs衍生的外泌体中表达减少，被OSCC细胞内化后通过AKT-GSK3β-β-catenin信号通路促进肿瘤的迁移和侵袭。一项研究将CAFs衍生外泌体中的miRNA测序结果与TCGA数据库中公开的OSCC相关病例数据集结合分析，发现CAFs所衍生的外泌体miRNA与舌鳞状细胞癌细胞免疫相关基因的表达之间具有一定的相关性，其中miR-139-5p为一种抑癌因子与免疫抑制有关，参与肿瘤的免疫调节。
低氧环境是TME的一项重要特征。据文献报道，在肿瘤发展的早期阶段，TME中的缺氧环境能够促使肿瘤细胞产生miR-21高表达的外泌体，通过靶向YOD1使正常成纤维细胞被激活转化为CAFs ，从而促进OSCC的进一步恶化。有研究分析了HPV+CAL27衍生的外泌体，发现外泌体能够将其中富含的miR-9-5p转移至成纤维细胞中，降低NOX4和活性氧的水平，进而抑制转化生长因子β1诱导的α-平滑肌肌动蛋白，使得患者具有相对良好的预后。
1.2.2 肿瘤细胞与血管内皮细胞
外泌体miRNA在肿瘤细胞和血管内皮细胞之间的传递能够激活血管生成相关信号通路，调控血管生成过程进而影响肿瘤疾病的发展。例如，miR-221和miR-205-5p均在OSCC细胞衍生的外泌体中过表达，在被人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell， HUVEC)内化后能够调控该细胞的血管生成活性，促进肿瘤进展。
Wang等研究了在内质网应激条件下OSCC细胞分泌的外泌体miRNA的特征，发现miR-424-5p在肿瘤细胞衍生的外泌体中高度上调，并通过作用于其靶基因LAMC1来调控Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制HUVEC血管生成和迁移。缺氧的TME对于肿瘤的血管生成也具有促进作用。
Capik等将OSCC细胞在缺氧环境中进行了处理，研究发现OSCC细胞在缺氧环境中衍生的外泌体能够介导miR-1825进入HUVECs，引起TSC2/mTOR轴失调从而激活血管内皮细胞的活性，促进血管生成。
1.2.3 肿瘤细胞与肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated mucrophage， TAM)
TME中含有多种免疫细胞，例如巨噬细胞，位于肿瘤微环境中的巨噬细胞称为TAM。已有研究表明了TAM与OSCC的相关性，该细胞介导的相关途径能够引起OSCC的不良预后。有学者检测了OSCC细胞衍生的外泌体中致癌miRNA谱，发现miR-21在先天免疫相关途径中富集的外泌体miRNA中高表达最为显著，在其通过外泌体被单核细胞及巨噬细胞吸收后，能够调节核因子-κB通路引起肿瘤的进展。
TME中不同的信号分子使得巨噬细胞分化为两种不同的亚型：M1型为经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophage)，具有免疫监视功能；M2型为替代性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophage)，通过免疫抑制促进肿瘤进展。
OSCC细胞衍生的外泌体能够影响TME中TAM的极化。研究表明，将OSCC细胞衍生的过表达miR-29a-3p的外泌体与巨噬细胞共培养时，该外泌体miRNA能够通过靶向SOCS1调节巨噬细胞中的SOCS1/STAT6信号通路而有效促进巨噬细胞向M2亚型分化，间接诱导肿瘤细胞的增殖和侵袭。
在关于OSCC的研究中，研究者发现HPV+型肿瘤细胞及其衍生的外泌体中miR-9过表达，进而促进了巨噬细胞的M1极化并增强了肿瘤细胞对放射线的敏感性。
巨噬细胞产生的外泌体同样也能够通过转移miRNA对肿瘤细胞的增殖、迁移以及凋亡等产生影响。一项研究运用高通量测序分析了M1和M2型巨噬细胞衍生的外泌体中miRNA的差异表达情况，结果显示miR-23a-3p显著差异表达，进一步研究发现由M2型巨噬细胞衍生的外泌体能够将miR-23a-3p转移至OSCC细胞中，通过靶向磷酸酶和紧张素同源物调控相关信号通路，引起波形蛋白、E-钙粘蛋白以及基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9等与肿瘤迁移相关的蛋白表达上调，增强肿瘤的迁移能力并抑制细胞凋亡。
2. 外泌体miRNA作为OSCC诊断和预后的分子标志物
近年来，尽管OSCC在治疗方法上取得了多项有意义的进展，然而OSCC的死亡率和5年生存率仍不能够达到理想的水平。无法在肿瘤发生的早期进行及时精准的诊断是OSCC高死亡率的主要原因之一。因此，探索一种简便高效且准确的非侵入性诊断方法对于提高OSCC患者的5年生存率具有重要意义。
液体活检是通过取样血液、唾液、脑脊液等外周体液对疾病进行诊断，运用分子分析手段为肿瘤的诊断提供方向并实时监测肿瘤的变化，在一定程度上能够避免因组织异质性对诊断造成的影响，当前以血液为样本的液体活检应用最为广泛，主要是检测血液中游离的循环肿瘤 DNA、循环肿瘤细胞和外泌体后进行分析，同时，在OSCC患者体内，针对唾液的液体活检也具有一定的价值。
2.1 血浆来源的外泌体 miRNA
传统的液体活检多采用血液作为标本(包括全血、血清、血浆)，这种检测标本稳定性好且对肿瘤组织内部的差异基因具有良好的代表性。OSCC患者血浆中的外泌体水平与患者预后有密切关系。
一项研究聚焦于血浆外泌体miR-130a，证明了来源于OSCC患者血浆中的外泌体miR-130a与OSCC组织中的miR-130a均出现了显著上调，同时血浆外泌体miR-130a与肿瘤的分化程度和疾病分期有关，因此血浆外泌体miR-130a对肿瘤诊断具有一定的意义。另一项研究分离并检测了血清中的外泌体miRNA，证实了miR-182在OSCC患者血清中高表达且具有潜在的预测肿瘤浸润深度的能力。
miRNA微阵列芯片技术被广泛应用于miRNA的研究中。Chen等运用miRNA微阵列分析筛选得到OSCC衍生的外泌体中差异表达明显的52个miRNA，在这些miRNA中，miR-155、miR-21、miR-205、miR-126、miR-20a、miR-32、miR-362和miR-101与OSCC患者的预后相关，尤其是miR-155、miR-21 、miR-126被认为是OSCC诊断和预后的非侵入性生物标志物。
2.2 唾液来源的外泌体miRNA
唾液在进行液体活检时最易于获得，同时自肿瘤原发部位的细胞衍生的外泌体在进入唾液后，其内携带的生物活性物质的变化能够提示肿瘤的分期、侵袭性等特点。因此，采用唾液作为液体活检的标本对OSCC患者的早期诊断具有重要的作用。
一项研究对10例正常对照组与45例OSCC患者的唾液外泌体进行了miRNA微阵列分析，提出了唾液外泌体miR-24-3p可以通过靶向PER1维持OSCC细胞的增殖，是一种潜在的新型OSCC诊断生物标志物。有学者发现，与健康对照组相比，OSCC患者的外泌体miR-486-5p升高，miR-10b-5p降低，是潜在的
唾液中的外泌体miRNA对OSCC的分期以及侵袭性也具有提示作用。有研究利用逆转录-
Patel等通过miRNA测序分析了23例OSCC患者和21例健康志愿者的唾液外泌体中miRNA差异表达情况，结合TCGA数据分析后，鉴定出miR-140-5p、miR-143-5p和miR-145-5p在肿瘤患者唾液外泌体中显著低表达，在预测肿瘤疾病的进展以及疾病的不良预后方面有着较高的指示性。
3. 外泌体miRNA在OSCC治疗中的应用
外泌体是携带miRNA等小分子和递送药物的理想载体。鉴于部分miRNA对OSCC患者体内的肿瘤发生发展具有调节作用，一些研究者正在探索通过外泌体作为载体装载miRNA用于治疗OSCC。一项研究通过共孵育的方式将胆固醇修饰后的miR-34a装载到HEK293T细胞衍生的外泌体中，将miR-34a精准运送至靶细胞从而抑制OSCC的增殖、迁移和侵袭。
肿瘤细胞
当前多烯
在外泌体介导的肿瘤细胞通讯中，细胞内相关信号通路的改变可能会导致外泌体分泌异常，影响细胞内肿瘤相关miRNA的含量而引起肿瘤细胞表型的改变。鉴于外泌体的释放可能引起OSCC细胞相关表型的恶化，通过抑制外泌体的释放来阻止疾病的恶化同时可以作为肿瘤治疗的一个探索方向。Dickman等发现当外泌体输出蛋白Rab27A被抑制后外泌体miRNA无法正常排出，从而引起细胞内miR-142-3p含量增加，肿瘤细胞的恶性表型被抑制。
4. 小结与展望
随着对外泌体在肿瘤发生发展过程中相关机制探索的不断深入，外泌体miRNA在OSCC的诊断和治疗中的应用展现出巨大的前景。外泌体miRNA不仅对肿瘤的各种状态及疾病发展和患者生存期等具有良好的预指示意义，有助于OSCC的早期筛查，而且由于外泌体能够在细胞之间精准传递信号分子，以外泌体为载体运送肿瘤相关miRNA以控制疾病进展在OSCC的治疗方面也有着巨大潜力。同时，与外泌体miRNA有关的机制探索也为揭示通过调节外泌体及其运送的miRNA含量以阻滞与OSCC进展相关通路的可能性，为OSCC的治疗提供了新思路。
然而，当前研究缺乏某一关键的miRNA能够精确指示OSCC相关进展，难以向临床应用中推广，因此在未来的研究中应进一步致力于寻找更具有普遍性和代表性的miRNA作为标志物。同时，纵观对于外泌体应用于OSCC治疗的相关研究，由于外泌体释放及内化的相关机制仍不明确，且对于其调控OSCC进展的关键通路仍未有定论，大多数研究仍是局限在细胞系或动物模型中，对于该方面基础医学研究与临床药物开发的转化研究极少。
关于将外泌体miRNA对OSCC的调控机制转化为治疗方式仍存在多种途径值得探索，通过负载相关miRNA改变患者体内免疫细胞的活跃程度以发挥免疫激活或免疫抑制的功能来调控疾病进展在其他一些癌症中已被探索，然而在OSCC中，此方面的研究仍是空白。同时，在利用外泌体运送miRNA等靶向药物的过程中，外泌体可能会被机体识别为一种外来的抗原，从而引起机体的免疫反应及其他某些不良反应。未来在利用外泌体治疗的过程中，这也是一个亟待解决的问题。
来源：王菁，徐文华.外泌体微小RNA在口腔鳞状细胞癌中的研究进展[J].口腔医学研究，2024，40(10):855-860.
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