作者：谢狄亚，肖涛，单丹妮，周婷，王志勇，南京大学医学院附属口腔医院
目前，口腔
对头颈肿瘤外科医生而言，术前准确评估、术中精准判断肿瘤切除的范围和确保手术的安全切缘是完整切除口腔癌、减少复发的关键。然而，为了实现所谓的“根治”目标，不加限制地扩大手术范围，不仅不能有效控制复发，提高患者生存率，反而可能由于牺牲大量健康组织，导致患者术后容貌受损严重和口颌功能（如语音、咀嚼、吞咽等）丧失，严重影响患者的生活质量。因此，精准而完整地切除肿瘤一直是头颈肿瘤外科面临的挑战。
现阶段的临床实践中，对口腔癌手术切除范围的判断主要根据术前影像学检查[ 如计算机体层成像（computed tomography，CT）、
然而，临床实践中该技术手段也存在一定的限制，如选择检查区域的主观性和盲目性，常导致采样误差。虽然采取连续切片对切除标本进行整体切缘评估能减少误差，但其在实际中的应用受到时间和人力资源的限制。此外，术中冰冻活检结果为“阳性”切缘时，术者需面对术创可疑肿瘤残留部位精准定位的难题。跨越这一术前影像与术中现实之间的“鸿沟”，目前仍缺乏一种有效而客观的“桥梁”技术。近红外荧光（NIF）成像是将不可见的近红外荧光转化为可视图像的技术。
1948 年，Moore 等最早发表了将荧光应用于神经外科脑部肿瘤定位的报道，此后逐渐形成了荧光引导手术（FGS）技术。该技术为临床医生在手术中提供实时的辅助信息，具有精准、无创、无放射性等优势。近年来，伴随着精准医疗的需求以及诊疗新技术的发展，一系列应用于临床辅助的近红外荧光引导手术（NIR-FGS）系统成功研发，推动了NIF 成像技术在肿瘤外科的临床应用。该技术的科学性、安全性和有效性已经在多种癌症的临床应用中得到了研究和验证。
在口腔癌的手术治疗中，NIR-FGS 的应用能够为术者提供多方面的辅助，包括定位肿瘤组织、辅助界定肿瘤的切除范围、观察颈部淋巴结转移情况和评估移植皮瓣血供等，展示了广阔的应用前景。2023 年，在
1. 荧光成像技术原理及荧光成像剂
1.1 荧光成像技术原理
荧光是一种在自然界中非常普遍的现象。当荧光物质受到外界能量（比如外源性光照）激发后，该物质原子核周围的电子从基态能级跃迁到能量较高而不稳定的激发态，随即电子回归基态的过程中，释放出能量，这些能量以光子的形式释放从而产生荧光现象。荧光物质发射的荧光信号强度与荧光素的量在一定范围内呈线性关系。利用这一特性，以荧光物质为示踪分子，通过光学或光电技术将荧光适时显现或成像，这一技术被称为荧光成像技术。
它能够在分子尺度上定位标志物，并可用于观察其在机体细胞和组织中的分布情况，评价器官的功能状态。NIF 是指荧光波长超出可见光范围（400~650 nm），波长在650~1 700 nm 近红外区范围内的荧光。NIF 因具有较长的波长，其在组织内能获得一定的穿透深
NIF 成像可经由特定的荧光成像系统完成，成像系统通常由光学模块和图像处理模块组成，集成有荧光信号激发和收集套件（激发光源、光路传输组件等），以及信号检测和放大系统。通过对NIF 的采集、光电信号转换及计算机数据处理，它可以实现对生物体内含有NIF 显影剂的细胞或组织的观察和分析。
1.2 应用于临床的荧光显影剂
NIF 成像技术的临床应用，不仅需要灵敏的成像系统，更为重要的是荧光显影剂在目标区域的富集，并与正常组织产生足够的信号对比。这种目标组织与正常组织之间的信号强度比值，被称为成像对比度或信号背景比（signal to background ratio，SBR）。一般认为，目标区域与正常组织的SBR 大于1.5 可定义为荧光阳性，其成像效果较为理想。因此，临床医学成像理想的荧光显影剂需要在正常组织有较少的非特异性蓄积。当然，生物安全性是首要也是最重要的评价维度。
目前已被批准应用于临床的荧光显影剂屈指可数，已知的有
5-ALA是生成血红素的前体物质，由于肿瘤细胞与正常细胞的代谢差异，肿瘤细胞内会优先聚积由5-ALA诱导生成的原卟啉Ⅸ（激发波长：407 nm，发射波长：635 nm）。在临床中，5-ALA 主要用于引导
ICG 是目前临床应用最为广泛的NIF 显影剂。它是一种带负电荷的水溶性花菁类染料，分子质量为776 Da，最大激发波长为780 nm，最大发射波长为820 nm。大量的临床实践证明，ICG 具有良好的生物相容性，不参与体内化学反应，主要经肝肠循环代谢排出体外，无皮肤和其余正常组织的蓄积。
普遍认为ICG 在肿瘤内的富集机制是其经静脉注射后迅速与血浆蛋白结合，形成直径5~10 nm大小的复合物，通过肿瘤病变组织内结构异常的血管、淋巴管，产生增强的渗透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR），从而形成富集。因此，应用ICG 开展NIR-FGS 可区分出肿瘤病变组织与正常组织。此外，ICG 也可通过瘤周注射的方式定位恶性肿瘤的SLN。
ICG 注射后会与组织间隙内的蛋白质结合，进而沿淋巴管引流富集到淋巴结中，通过荧光成像观察可发现最先显影的SLN 。基于ICG 的FGS（ICG-FGS）技术目前较为成熟，已在肝脏外科、乳腺外科、神经外科等众多领域的临床诊疗中得以应用，在口腔癌手术中的应用也方兴未艾。除了上述NIF 显影剂以外，从增强靶向性和特异性角度提高SBR 的荧光显影剂亦已进入临床试验阶段。
其中，商用NIF 染料IRDye 800CW，因其具有良好的水溶性，结构可经设计后与靶向抗体偶联，由此开发出的荧光显影剂已被用于体内成像性能的评估。以Panitumumab-IRDye800CW、Cetuximab-IRDye800CW 等为代表的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）靶向荧光显影剂目前有多项临床试验正在推进。
一项纳入21 例头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamouscell carcinoma，HNSCC）患者的临床试验结果显示，术前注射Panitumumab-IRDye800CW 后，在体内实时观察患者肿瘤的SBR，为2~3，而体外标本的SBR 为5~6，阳性和阴性标本之间的信号差异为3 倍（差异有统计学意义）。该显影剂的敏感度和特异度超过89%。此外，在口腔癌SLN 的检测中，该类显影剂也显示出了其临床应用的潜力。
临床研究报道，Cetuximab-IRDye800CW 和Panitumumab-IRDye800CW 标记的口腔癌患者颈部转移淋巴结平均荧光强度显著高于阴性淋巴结，具有较好的敏感度、特异度和阴性预测值。这些新开发的靶向NIF 显影剂展现了良好的特异性和安全性，其诊断价值、有效性和可行性还有待更进一步的临床验证。
2. ICG-FGS 辅助口腔癌治疗的临床应用
NIR-FGS 在肿瘤治疗中的应用主要包括以下几个方面：①辅助界定肿瘤的边界，确定肿瘤病变的切除范围；②识别隐匿性病变（原发病灶之外的隐匿性肿瘤、肿瘤手术切缘及SLN）；③识别重要的相关解剖结构。口腔癌手术目前主要将ICG 作为显影剂辅助术中肿瘤病变的切除、颈部淋巴结的定位，以及血管化游离移植皮瓣的血供监测。
2.1 ICG-FGS 辅助口腔癌病变切除
应用ICG-FGS 辅助口腔癌手术切除时，一般采用静脉注射荧光显影剂ICG 的方式，这种方式可避免局部注射显影剂后发生渗漏造成的正常组织“污染”。进入机体的ICG 随血流分布于全身各处组织中，并经肝脏分解，通过胆汁和尿液排出体外。因此，为了使蓄积在肿瘤组织与分布于正常组织的ICG 荧光信号产生足够的SBR 差异，以便FGS系统准确识别与探测，静脉注射ICG 时须确定合适的注射剂量和观察窗口期。根据已有的研究报道及我们的临床验证，ICG 静脉注射的推荐剂量是0.75~1.25 mg/kg，观察窗口期是注射后6~12 h。
口腔癌手术切除时，ICG-FGS 主要在以下场景中提供辅助：肿瘤原发灶切除时评估切除范围、切除后评估体外标本切缘的安全距离和取材切缘的状态及切除后瘤床的观察和评估。国外临床试验和我们的临床应用均证实，ICG-FGS 可准确识别OSCC 患者原发肿瘤的荧光信号，且在肿瘤切除后的瘤床上也能检测出残余癌细胞。
对于局晚期口腔癌，应用ICG-FGS 辅助手术时，患者的切缘异常率更低。对ICG-FGS 用于头颈癌切除术可行性和有效性的系统评价研究表明，平均肿瘤SBR 为1.56，总敏感度和特异度分别为97.7% 和71.9%。由此可见，ICG-FGS 在实时肿瘤边界评估，涉及重要结构、浸润程度较深的局晚期口腔癌切除中，可提供安全切缘和完整切除指导，从而有望提高手术切缘阴性率和患者无进展生存期。
值得强调的是，现阶段的FGS 临床应用主要是提供直观可视化的信息，以辅助术者的手术决策，尚不能完全替代
2.2 ICG-FGS 辅助颈部淋巴结清扫
口腔癌的颈部淋巴转移具有跳跃转移和隐匿转移的特点，其SLN 位置也不恒定。ICG-FGS 辅助口腔癌颈部淋巴清扫，可以在术中定位SLN，并辅助医生判断淋巴结的转移情况。应用ICG-FGS 辅助口腔癌颈部淋巴清扫，可以将ICG 通过静脉注射与瘤周注射的方式显示颈部淋巴结和淋巴引流通道。ICG 静脉注射需要在术前12~24 h 进行，而瘤周注射则需在30 min 内进行观察。
有研究比较了ICG 静脉注射和瘤周注射判断转移性淋巴结的差异，静脉注射和瘤周注射的敏感度和特异度分别为62.5%/75% 和98.1%/89.1%。虽然作者认为两种技术各有优缺点，但我们更倾向选择ICG 的瘤周注射。将ICG 与人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）混合后局部注射，可以减少ICG 以小分子形式弥散渗透在注射区域周围导致视野区荧光干扰，实时、便捷地获得了更好的淋巴结引流成像效果，且转移淋巴结也表现了较正常淋巴结更强的荧光亮度。
基于ICG 荧光检测SLN和转移淋巴结的系统评价研究显示，该技术的总体敏感度和特异度分别为86% 和91%，ROC 曲线的曲线下面积（area under curve，AUC）为0.93，表明ICG-FGS 在SLN 的早期检测和转移判断中具有一定的诊断价值。
也有研究报道，术前使用CT淋巴造影（CT lymphangiography，CTL）技术评估颈部淋巴结，绘制SLN 定位图，结合术中ICG-FGS 技术更有助于识别口腔癌颈部SLN。目前，FGS 辅助口腔癌颈部淋巴结清扫的技术尚处于敏感度和特异度的验证阶段，对于颈部淋巴结是否转移的最终判断和验证，还需以病理结果为准。尚未有明确的证据支持该技术可以改变颈部淋巴结清扫的手术决策。特别值得注意的是，在临床应用该技术时，可能存在假阳性或假阴性的结果，这可能会导致过度或更保守的治疗。
2.3 ICG-FGS 辅助口腔颌面部缺损的修复重建
游离皮瓣移植技术是目前口腔颌面部组织缺损修复重建外科的常用手段。然而，术中血管损伤及术后血管危象时有发生。临床实践中，对供区血管的术前评估及术后血管危象并发症的及时发现与诊断，主要依赖B 超和
通过静脉注射，ICG 快速与血浆蛋白结合，短时间内无法渗入组织间隙，可以在FGS 系统下实现血管清晰的显影。在皮瓣设计和制备阶段，ICG-FGS可以帮助术者观察皮瓣区域的血管网络，定位穿支血管，避免重要血管的损伤，从而提高皮瓣移植的成功率。研究表明，相较于传统的B 超技术，ICG-FGS 技术具有更高的灵敏度，能够发现更多的皮瓣穿支血管。在血管吻合完成后，还可用于观察移植皮瓣血管通畅程度和血流再灌注情况。
一项基于ICG 的血管造影术的临床研究发现，以荧光强度为依据反映游离皮瓣血流再灌注的参数与灌注相关的并发症发生有很强的相关性。术后观察期，尚可通过对皮瓣荧光强度的分析判断皮瓣是否存在因血管阻塞而发生血管危象的可能，在术后皮瓣监测中，ICG-FGS 显示了其独特的优势。ICG的体内代谢特点使其在正常肌肉和皮肤组织内的蓄积较少，静脉推注后，ICG 可短暂滞留于循环血管网内，因而存在一定的血管成像观测窗口。
通常情况下，血管显影的观察时间在注射后10 min 内。在观察窗口期内，ICG-FGS 系统不仅能够直观地提供皮瓣血流灌注的视觉图像，还能通过对移植皮瓣荧光强度的检测进行定量分析。必要时，该技术还可在满足一定时间间隔后（为避免造影剂残留造成干扰），重复多次注射，进行观察和检测。采用ICGFGS对术后游离皮瓣的连续监测的研究表明，该技术可比临床观察更早检测出血管并发症。
对于ICG-FGS 技术辅助游离皮瓣移植的一项回顾性研究报道了皮瓣的总失败率、再探查率和皮瓣挽救率。在应用ICG-FGS 辅助的患者中，3.9%的皮瓣完全失败，33 例（13.5%）需要重新探查，33 例接受挽救治疗的患者中有25 例(75.8%) 获得成功；未应用ICG-FGS 患者的皮瓣完全失败比例为8.4%，有40 例（15.3%）需要重新探查，35 例接受挽救治疗的患者中有18 例(51.4%) 获得成功。研究结果提示，在游离皮瓣手术中，ICG-FGS 技术能够显著降低游离皮瓣移植的总失败率，提高挽救率，但不影响探查比例，其在辅助游离皮瓣修复重建中具有重要的临床应用价值。
3. 挑战和展望
NIF 成像技术在口腔癌及其引流淋巴结的手术切除及皮瓣修复重建的血供观察中展现了临床价值，然而该技术在实际临床应用中还存在着一些问题和挑战。首先，回顾以往的研究发现，目前的临床实验和研究主要集中于NIF 成像技术的诊断价值评价方面，对于传统手术和NIR-FGS 之间的对照研究几乎没有，缺乏NIR-FGS 对术中决策影响的评估报告。依据荧光引导改变术中决策对该技术的临床价值评价至关重要。
NIR-FGS 的有效性和安全性是否与患者的长期结局相关也需要更多的临床实验评估和长期的随访结果观察。其次，在NIF 成像技术层面，现有的成像系统尚难以彻底解决临床问题。对位置深在或浸润达到一定深度的口腔癌，由于现有的ICG-FGS 成像探测深度约为5 mm，且成像为平面图像，因此很难完整提供口腔癌的相关信息。
将现有的NIF 成像与MRI 或CT 等具有三维成像特点的影像技术结合，构建多模态成像系统，为口腔癌手术治疗提供更全面、准确的适时信息，可能是未来可行的技术发展方向。机器学习和人工智能的引入则有望提高对NIF 成像数据的分析和解释能力，而更小型、安全、智能的设备也有助于推动该技术的临床广泛应用。此外，现有在临床使用的荧光显影剂，如ICG，还存在主动靶向性差、穿透深度浅、荧光量子产率低等问题，这也是ICG-FGS 在临床应用中特异度差和假阳性率高的原因。针对这一临床问题，研发新型荧光显影剂成为目前的研究热点。
已有研究报道，利用抗体偶联技术制备的靶向显影剂表现出了更优秀的灵敏度和特异度，能减少周围正常组织的干扰。二窗荧光（波长在900~1 700 nm）材料因其具有更好的穿透深度和成像精度，展示了更优异的荧光性能。纳米技术可以设计出具有多功能的纳米粒子，因而被用于提高NIF 成像的质量和特异度，甚至引入免疫或光热分子基团达到一定的治疗效果。包括纳米材料在内的新型NIF显影剂的开发在临床试验中展现了一定的应用潜力，但筛选出适合临床应用的新型荧光显影剂所需要的巨大开发成本和风险因素，限制了其临床应用的研究。
对已应用于临床的显影剂进行性能改进和新用途的探索是一条可供选择的途径，而远期对新型荧光显影剂安全性的评估应是未来研究值得重点关注的方向。NIF 成像技术除了应用于口腔癌的FGS 中，该技术在口腔癌的筛查、癌前病变的预警、癌症阶段分期等应用中也有报道。这些研究着重于NIF成像技术的定性分析，其诊断的特异度还有待改进。通过荧光强度定量分析口腔癌演变的可行性和有效性，需要更多的大规模临床研究提供数据，以便对该技术进行临床验证和标准化操作，并提供循证医学依据。除了对荧光强度的定量分析外，基于荧光成像剂在不同组织中的代谢差异，“荧光寿命”这一概念的提出也为NIF 成像的定量研究提供了新的角度。
综上所述，NIF-FGS 在口腔癌治疗中的应用前景令人振奋。通过跨学科的合作，有望不断改进这一技术，从而将之推向更为广泛的临床应用中，整体提高口腔癌患者的治疗效果。
来源：谢狄亚,肖涛,单丹妮,等.近红外荧光引导手术在口腔癌治疗中的应用及展望[J].口腔颌面外科杂志,2024,34(04):251-258.
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