作者：Yang SM, Cao D, Jaijyan DK, et al . Identification and characterization of Varicella Zoster Virus circular RNA in lytic infection. Nat Commun, 2024, 15(1):4932.
译者：深圳大学医学部生物医学工程学院，医学超声关键技术国家地方联合工程实验室，广东省生物医学信息检测与超声成像重点实验室；深圳大学第六附属医院（南山医院）疼痛医学重点实验室，杨少敏 译，深圳大学第六附属医院（南山医院）疼痛医学重点实验室，肖礼祖 校
1.主要研究背景
初次感染后，VZV 在背根神经节(dorsal root ganglion, DRG) 和三叉神经节(trigeminal ganglia, TG) 中终身潜伏。当机体免疫力下降时，潜伏的VZV 可重新激活；大量复制并沿感觉神经纤维向所支配的皮节扩散引起水痘皮疹，称为带状疱疹。由于这个过程VZV 破坏其神经元，导致神经元功能紊乱、异位放电、外周及中枢敏化，导致带状疱疹病人在出疱疹期间及疱疹愈合后出现神经痛，称为带状疱疹相关性神经痛。
VZV 病毒基因组大小约为124 kb，传统认为其大约编码71 个开放阅读框(open reading frame, ORFs)。在VZV 激活阶段（即裂解性感染，Lytic infection），71 个ORFs 均可转录大量病毒RNA。但在潜伏期间，几乎所有基因均处于静息状态，仅在ORF61 附近表达VZV 潜伏相关转录本(VZV latency-associated transcript, VLT)。
近年来研究者发现了许多新的VZV转录物、转录物异构体和未知的剪接事件，表明VZV 的基因转录结构非常复杂。环状RNA (circular RNA, circRNA) 是一类通过反向拼接首尾共价闭合环状结构的单链RNA分子。与mRNA 相比，因circRNA 具有更加稳定的优势，已成为继mRNA 疫苗之后下一代治疗方法的新兴关注焦点。
近年的研究发现多种人类病毒可编码病毒衍生的circRNA，例如丙型肝炎病毒和默克尔细胞多瘤病毒。然而，这些病毒circRNA 的形成机制及生物学功能尚不清楚。前期该团队已率先报道了人巨细胞病毒和冠状病毒(SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV) 可产生病毒来源的circRNA。该研究首次充分证明了VZV 的感染过程可产生具有重要生物学功能的病毒来源circRNA。
2.研究结果
1） 宿主环状RNA 响应VZV 感染的动态特征
对VZV 感染神经母
2） VZV 编码circRNA 的鉴定与表征
为了绘制高分辨率的VZV circRNA 图谱，本文作者采用BGISEQ 短读测序和ONT 长读测序两种平台。结果表明病毒circRNA 随VZV 感染时间而增加，较长的circRNA 表达水平较低；大部分VZV circRNA 为局部近端拼接，在ORF9 和ORF61 附近产生更多的circRNA。接着，分别对两种平台的数据进行circRNA 全长组装。
对于短读测序，CIRI-full重建了42,563 个人类全长circRNA 和71 个全长VZVcircRNA。而长读测序CIRI-long 鉴定出1,2407 个人类全长circRNA 和1358 个全长VZV circRNA；这体现了ONT 滚环长读序列检测病毒circRNA 中更高的效率和可靠性。进一步分析发现，大部分的VZV 和细胞circRNA 都含有多个环状外显子；VZVcircRNA 平均长度比细胞短；VZV circRNA 无链偏好性。有趣的是，本文作者发现一类含有多种异构体的VZV circRNA，且与VZV 潜伏期相关转录本(VLTs) 同源，将其命名为circVLTSlytic。
3） VZV 感染细胞中病毒circRNA 的实验鉴定
为了验证VZV 编码的circRNA 是否真实存在，本文作者精心设计一系列特异靶向circRNA 的反向引物，利用RT-PCR、TA 克隆、Sanger 测序、RNase R 耐受性测试和链式反应原位杂交 (Amp-FISH) 等多项实验技术充分证实VZV 感染体外细胞可编码circRNA。更重要的是根据该流程进行了大规模VZV circRNA 实验验证，总共鉴定到200 个VZV circRNAs。这为病毒circRNA 算法开发提供了强大的训练数据集。
4） 带状疱疹病人组织和临床毒株中VZV circRNA的鉴定
为了进一步确定VZV circRNA 在体感染过程中是否存在，共收集了6 名被诊断为带状疱疹病人的水疱液组织样品，与此同时还从病人水疱液组织中分离到VZV 临床株。经过RT-PCR 和Sanger 测序证明带状疱疹病人水疱液和临床VZV 毒株感染中均存在VZV circRNA，其中circVLTSlytic 在以上两种样本中均存在。至此，该研究证实了VZV 感染过程中可产生病毒来源的circRNA。
5） circVLTs 的DNA 侧翼5' 剪接供体是VZVcircVLTSlytic 形成的重要顺式元件
当前已有多种DNA/RNA 病毒被报道可产生病毒circRNA，然而目前这些circRNA 在病毒致病过程是否具有生物学功能尚未确定。分析circVLTSlytic在基因组的位置发现，只有5 号外显子不与VZV经典基因（ORF 基因）发生重叠。因此，该研究利用细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC) 系统在pOka 株（该病毒株已经插入了GFP和luciferase 双荧光报告基因）基因组DNA 水平进行20 个随机碱基替换突变，并产生pOka-M1（5'剪接供体下游突变）和pOka-M2（5' 剪接供体上游突变）突变VZV 株。
结合RNA-seq 和qPCR 检测，结果表明circVLTSlytic 外显子5 突变轻微抑制了RNA 转录，且外显子5 与外显子1 有相互作用；DNA 侧翼5' 剪接供体附近序列对VZV circVLTSlytic剪接形成起关键作用，是VZV 感染细胞后circVLTSlytic生物发生和表达所必需的顺式作用元件。
6） circVLTSlytic 外显子5 的突变使VZV 对阿昔洛韦更敏感
通过病毒生长曲线分析和荧光素酶报告基因检测发现circVLTSlytic 外显子5 突变不影响VZV 的生长。有趣的是，用IFN-β、ACV 或RDT 三种抗病毒药物处理感染细胞给予VZV 生长压力，却发现pOka-M1 对ACV 的敏感性增加。
进一步的补救实验以及体外培养的人类皮肤、DRG 以及人皮肤组织移植小鼠模型的感染均与上述结果一致。这些结果表明，circVLTSlytic 是VZV 复制的非必需分子，但其存在有助于VZV 抵抗抗病毒药物。进一步的研究表明，circVLTSlytic 可能通过调控VZV基因的表达，从而响应抗病毒治疗。
3.总结
circRNA 是转录组中一种新的重要成分，该研究报道了VZV 感染的细胞和带状疱疹病人组织中可产生病毒来源的circRNA。此外，VZV 编码circVLTSlytic 参与VZV 抵抗阿昔洛韦的抗病毒作用。该研究扩展了人们对VZV 转录组成分的认识，为带状疱疹的临床诊断以及下一代带状疱疹circRNA疫苗的开发奠定基础。
来源：Yang SM,Cao D,Jaijyan DK,等.水痘-带状疱疹病毒编码circRNA的鉴定与表征[J].中国疼痛医学杂志,2024,30(08):561-562.
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