作者：保定市第四中心医院骨科 杜志坡
随着经济发展，人口老龄化趋势加重，退行性疾病、先天性异常和创伤等发生概率不断增加，对组织修复和器官重建的需求也随之增多。组织修复和器官重建基于组织再生，即通过内源性干细胞或祖细胞的活化、增殖以及新基质的产生，将组织修复为正常组织的相似结构和功能。然而，当原始组织存在破坏性缺陷或组织功能障碍时，人体将无法正确自动再生其大部分主要组织和器官。同时，由于部分组织再生能力低，炎症对伤口修复的负面影响以及随着年龄增长宿主干细胞/祖细胞群质量的降低，也会破坏活体组织自动再生的潜力。因此，组织工程和再生医学通过构建替代性生物组织，甚至整个器官来替代受损、恶化或丢失的身体部位，或通过刺激患者自身固有的治愈潜力加速再生。
作为组织工程学的三个关键因素之一，生物材料充当临时细胞外基质（ECM），提供机械支持并辅助物质运输以促进细胞黏附、增殖和分化，并以时空精度呈现物理化学信号来调节细胞行为，指导正确的组织再生。因此，理想的生物材料应在较长时间内提供暂时结构支撑，并以与新生组织相近的再生速率通过受控的方式降解和吸收。此外，通过加载活性分子（包括细胞趋化因子、细胞黏附肽等），生物材料可以促进干细胞募集及分化，从而提供足够的修复细胞，指导新的组织形成和整合。因此，生物材料通常模拟天然ECM的组成、结构及机械和生化特性，以创造有利微环境以诱导组织形成。然而，由于天然ECM的复杂性，传统的物理化学方法很难重建与天然ECM相同的支架。脱细胞外基质（dECM）由于较好地保留了天然ECM的复杂成分、宏观结构和表面微结构，已成为一种十分具有潜力的组织工程支架材料。dECM包括组织来源dECM（TDM）和细胞来源dECM（CDM），是通过物理、化学或生物化学等方法去除组织/器官、细胞膜片中的细胞及其他抗原成份，从而获得接近ECM的天然结构与形状，并保留了活性成份和维持形状的蛋白、纤维、多糖、胶原等成份的ECM材料。TDM即是从组织或器官中经过脱细胞处理提取的ECM，已被广泛用作组织工程生物支架，并获得了突出成果。
当前，基于TDM的研究主要集中在小肠黏膜下层、心脏瓣膜、血管、皮肤、神经、肌腱、韧带、膀胱、声带、羊膜、心、肝、肺等。然而，尽管TDM在组成、微结构和生物力学特性方面具有许多优势，但其效用受到来源组织或器官的可用性、几何形状和特性的限制；并且TDM难以获得特定组织区域，如特定发育阶段分化细胞周围的ECM。随着3D打印等技术的出现，TDM在结构和机械性能上的优势已不显著；此外，TDM都是同种异体或异种来源，这一特征增加了病原体传播潜在风险，并容易引发不良炎症和免疫反应，导致再生组织和器官的不良后果，并且其供体组织和器官来源非常有限。为了避免上述TDM的问题并维持近天然组织成分带来的高生物活性，CDM提供了一种有前途的支架制备方法。本文将对CDM的优势、制备及表征及其在组织工程中的应用综述如下。
CDM的优势
CDM是通过体外培养细胞1～6周后，将获得的细胞及ECM的混合物经脱细胞处理后得到的产物，这些产物可以支持人类干细胞的培养和分化。相比于TDM，CDM主要有以下优势：①CDM可以筛选培养的细胞病原体，在保持无病原体条件下获取ECM。②CDM可以提供所需的几何形状和孔隙度，不受脱细胞原生组织再生过程中细胞穿透性差的限制；此外，CDM可通过使用合成聚合物作为模板，生产出各种三维形状和结构的支架，并通过改性赋予其更多功能。③体外培养细胞操作灵活，可以根据组织特异性需求通过不同细胞类型和培养方法定制CDM。④CDM可以通过使用自体细胞避免同种异体或异种材料可能引起的宿主反应，并突破TDM供体组织和器官有限的局限。⑤CDM由于培养的细胞层较薄，选择较为温和的脱细胞方法即可达到较好的脱细胞效果，防止损伤ECM。TDM与CDM的具体比较见表1。
CDM的制备与表征
CDM可以在二维或三维细胞培养条件下制备以适应不同应用需求。CDM制备过程包括细胞扩增、接种、ECM生成/沉积和脱细胞4个主要步骤。其中，ECM生成/沉积是最重要步骤，需要创造理想的培养条件，才能刺激细胞更快地分泌和沉积所需ECM。制备的CDM需要对其成分与结构进行表征，符合安全要求后才能使用。一般来说，同种异体或异种细胞来源的CDM中DNA含量需保持在50ng/mg以下，以降低免疫原性反应风险。CDM成分与结构的表征方式见表2。CDM最终的组成和功能与细胞的培养条件和方法、细胞来源以及脱细胞方法息息相关。通过系统优化内在因素（例如通过基因改造细胞）和外在因素（支架、培养基、生长因子和物理兴奋剂），可以实现最终CDM产品所需的物理和生化特性。
细胞培养条件与方法的影响 细胞的培养条件与方法涉及培养基种类、培养平台、气体环境等。需要一定培养条件（如添加生长因子、旋转瓶生物反应器等）来控制细胞生长和ECM分泌，并根据需求选择合适细胞进行培养和扩增。除了一般的二维培养方法，三维细胞培养平台越来越受到人们关注。现有的三维细胞培养平台主要有中空纤维生物反应器、微载体（直径100～300μm，分为固体球形微载体和多孔微载体）、摇臂式生物反应器和滚筒式生物反应器。这些三维细胞培养平台通常通过增大细胞附着表面积、促进培养基中气体交换来显著提高细胞黏附密度，从而提高CDM的生产效率。具体使用哪种类型培养平台，需要根据细胞类型和使用需求选择。
不同培养方法与条件制备的CDM具有不同特性（成分、形貌、刚度等）和生物功能。Zhang等研究了在普通生长培养基和成脂培养基中培养的脂肪来源干细胞（ADSCs）构建的CDM对ADSCs的影响。在以上两种CDM上接种ADSCs后，发现ADSCs在普通生长培养基组CDM表面表现出更强迁移能力，而在成脂培养基组CDM表面经历了成脂分化。此外，缺氧、底物刚度等培养条件也会对CDM组成产生影响，缺氧可以改善成纤维细胞的胶原纤维沉积；基质硬度则会影响细胞表型，进而影响ECM的组成和性质。同样，基底形貌也可决定ECM的结构组织，微模具和凹槽的使用已被证明可在沉积的ECM中产生各向异性的纤维结构。
细胞来源的影响 不同来源细胞制备的CDM拥有不同的形貌、成分及生物学功能。Lu等研究了正常人BMSCs、关节软骨细胞和真皮成纤维细胞制备的CDM，发现3种细胞制备的CDM呈现出由不同ECM生物分子构成的微孔结构。此外，他们进一步检测了3种CDM的成分，发现存在细微差异。其中，BMSCs制备的CDM主要包含Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、
在功能方面，有研究通过将BMSCs、MC3T3成骨前细胞和成纤维细胞接种至纤维垫上，脱细胞制备不同的CDM并展开细胞成骨分化研究，结果发现，BMSCs制备的CDM促进了更强的成骨分化，成骨相关因子VEGF和BMP-2表达水平更高。Marinkovic等研究了由BMSCs和ADSCs制备的两种CDM分别对BMSCs和ADSCs的影响，结果显示，两种细胞在对应的CDM上培养时分别促进了BMSCs和ADSCs的增殖和分化。此外，研究表明，尽管不同CDM的结构蛋白处于相似水平，但其结构（纤维取向和致密性）仍然存在差异。有研究探讨了不同干细胞制备的CDM对于BMSCs迁移的影响。他们分别将BMSCs和肌腱源性干细胞培养在脱细胞牛跟腱表面，一段时间后脱细胞得到相应的CDM修饰支架；随后，将BMSCs培养在支架表面，发现两种干细胞制备的CDM均能促进BMSCs迁移，而肌腱源性干细胞比BMSCs分泌更多的基质细胞衍生因子1（SDF-1）和单核细胞趋化蛋白1，且主要通过SDF-1/趋化因子受体4轴激活PI3K/AKT信号通路来调节BMSCs的迁移功能。因此，可以根据需求有目的地培养细胞，以产生所需的ECM支架。近年，Carvalho等研究了由干细胞和人脐静脉内皮细胞共培养制备的CDM，与仅来自干细胞或人脐静脉内皮细胞的CDM相比，细胞共培养制备的CDM增强了人BMSCs的成骨分化，并能产生更成熟的矿化基质和更好地生成血管，表明细胞共培养制备的CDM在促进ECM环境方面具有协同作用。上述研究表明，CDM能够根据基质组成和生化线索来指导组织/谱系特异性再生，调节细胞行为。
根据不同组织的需求，通常选择相应的特异性细胞作为制备CDM的原料。然而，干细胞由于独特的生物功能而备受青睐，被广泛应用于制备修复各类组织的CDM，其形成的CDM是指导细胞活动的关键因素。干细胞逐步分化为体细胞的过程中，产生的ECM也是动态变化的，分化细胞分泌和沉积的ECM会根据发育、分化和组织再生的阶段继续进行重塑（即组装和降解）。来自体外干细胞培养物的CDM已被证明可以提供一种指导性的干细胞微环境，使衰老的祖细胞恢复活力，促进干细胞扩增和分化。多种干细胞（包括多能干细胞、BMSCs、滑膜来源干细胞、ADSCs、牙髓干细胞、脐带间充质干细胞等）制备的CDM在过去几十年里得到了广泛研究。经肌腱来源干细胞制备的CDM修饰的支架在体外显著改善了BMSCs的迁移，并且可以招募更多内源性基质细胞来加速体内肌腱-骨界面的愈合。在各种干细胞来源中，ADSCs显示出独特的临床应用优势。与BMSCs等相比，ADSCs可从脂肪组织中大量获得，且患者几乎无不适感；此外，ADSCs还表现出与中胚层来源细胞（脂肪生成、成骨和软骨谱系）相当的分化潜力。值得一提的是，除了ADSCs，在临床研究中还可以通过来自患者的活检组织或骨髓提取细胞开发无免疫原性CDM，避免发生与TDM相关的不良反应。
脱细胞方法的影响 脱细胞方法也会影响CDM的组成与结构，进而影响细胞功能。目前，专门用于制备CDM的脱细胞方法虽然报道很少，但用于制备TDM的脱细胞方法已有广泛而深入的研究。不同脱细胞方法（物理、化学、生物和混合方法）及其对TDM组成和微观结构的影响，在既往报道的综述文献中已有详细描述，总的来说几种方法各有优劣。物理方法虽然操作简单，不含化学试剂，可减少机体不良反应，但难以完全去除某些较厚组织的细胞；此外，机械搅拌等方法容易破坏ECM的结构，一定程度上影响其力学性能。化学方法虽然能在对ECM结构和组成影响较小的情况下有效去除细胞，但容易去除一些生长因子，降低ECM的生物活性；同时易残留试剂，降低生物相容性。生物方法虽然可以特异性去除细胞和抗原成分，且对其他生物活性成分损害较小，但容易损害蛋白质微观结构，且易发生由特异性酶残留引起的免疫反应。相比单一使用以上某种方法，混合方法更加安全有效，但需要根据特定组织的需求进行定制。
目前，用于TDM制备的脱细胞方法已应用于CDM的制备。CDM较薄，因此较温和的脱细胞方法（如循环冻融、TritonX-100）对CDM损害较小，适用于CDM的制备，尤其是在二维培养中制备CDM。此外，为了尽可能减小脱细胞过程对于CDM组分生物活性的破坏，有研究通过优化培养技术来实现。比如，有研究者构建了单个小尺寸三维细胞球体（几百微米），其可以实现温和而有效的脱细胞（使用TritonX-100），保护了组装的ECM的微结构和生物活性，重新接种细胞后，可以获得足够的氧气和营养，并均匀分布和增殖。但仍需要进一步研究专门用于CDM的脱细胞方法。
CDM在组织工程中的应用
如今，可以在各种培养条件下制备各类CDM，以满足细胞扩增、组织工程、生长因子的递送等特定应用需求。由于CDM的突出活性和可定制特性，其已成为组织工程领域一种富有前景的材料。见表3。目前，CDM在组织工程领域主要有4种应用方法，包括：①将细胞培养在平板上，一段时间后脱细胞处理，获得CDM薄片作为生物材料使用；②将细胞培养在颗粒状基板上，获得CDM球作为生物材料直接使用；③将细胞直接培养在多孔生物材料上，脱细胞后可获得由CDM修饰的生物材料；④将所得的CDM经
目前，直接培养在多孔生物材料表面获得由CDM修饰的生物材料支架在组织工程中应用最为广泛。其可以使支架在拥有CDM生物活性的同时具备模板支架的机械性能。此外，通过设计制备特定结构的模板支架，可以使CDM支架具有近天然组织的微结构，从而进一步提升活性。Gu等将雪旺细胞在壳聚糖纤维蛋白支架上培养，脱细胞后获得CDM修饰的支架以修复神经，结果表明该支架的再生作用与脱细胞神经移植物相似，且明显优于普通的壳聚糖/丝素蛋白支架。Tang等结合聚乳酸-羟基乙酸共聚物静电纺丝纳米纤维模板和人ADSCs制造用于伤口愈合的CDM修饰纳米纤维敷料，其保留了Ⅰ型胶原蛋白和层粘连蛋白，具有亲水性，并具有适合伤口愈合的适当机械强度；当接种成纤维细胞时，该纳米纤维敷料支持细胞存活和增殖。通过交联，CDM的稳定性和降解性能进一步提高。此外，CDM还可与3D打印联合使用。骨细胞来源的CDM与3D打印多孔聚己内酯支架相结合，与单纯聚己内酯支架相比，修饰了CDM的支架增加了间充质祖细胞的黏附、增殖和成骨活性。Pati等也开发了CDM修饰的3D打印支架，与裸3D打印支架相比，它可以通过调节4个典型的成骨细胞基因来促进人鼻甲间充质干细胞的成骨细胞分化，并增加钙沉积，诱导新骨形成。
为了获得具有理想功能的CDM支架，还可以针对表面诱导的ECM组装定制聚合物的表面微结构。如在具有2～6μm宽的垂直微纹理聚二甲基硅氧烷支架表面培养人成纤维细胞，其形态、黏附力和肌动蛋白细胞骨架发生了显著变化。在另一项研究中，通过在合成的取向纳米光栅上培养人真皮成纤维细胞，得到高度排列的纳米纤维CDM支架。由于保留了高度排列的弹性蛋白纤维，其弹性模量得到了很好维持。细胞重新接种后发现该活性支架可提供细胞黏附位点，并支持和指导细胞沿下层纤维增殖和排列。这些研究显示了CDM修饰精心设计的合成聚合物作为混合支架的前景，其结合了模板支架的结构和机械性能，以及细胞分泌的天然ECM大分子的生物学指导信号，超越了传统材料合成与制备方法的局限，在组织工程领域具有独特优势。
总结与展望
总的来说，尽管由于体外培养细胞ECM分泌模式不同于体内，ECM的体外自组装很难复制复杂的天然ECM体系结构。但是，与TDM相比，CDM具有无限的可用性、灵活的可调节性、对不同发育阶段的适应性和充分的安全性等优势，在组织工程方面仍然具有很大发展前景。但是，尽管CDM已被引入组织工程各种领域（如使用CDM制备人造组织和器官），目前仍只有CDM构建的人工血管在临床环境中进行了检测，而许多TDM已在各种组织中进行了广泛测试。因此，基于CDM的组织工程支架的开发及临床应用还需进一步研究。此外，CDM的规模化是局限其广泛应用的一个关键。一方面，需有合适的技术以保障足够量的ECM沉积；另一方面，要维持细胞在长期培养过程中不变性。虽然当前已有一些技术被开发用于促进ECM沉积，如添加抗坏血酸（
但是，在制造过程中，内在因素和外在因素的任何变化都会导致CDM产品的偏差。扩大生产规模首先要考虑形成稳定的细胞来源、培养基成分、生物反应器、化学品和加工方法。其中，原代细胞和细胞系等细胞来源在CDM的批次变异性中起主要作用。原代细胞本质上是可变的，因此必须实施适当的预表征和细胞库策略，以保持所需标准。在没有基因改造的情况下，只有来自主要来源的干细胞才有能力进行足够的细胞分裂，以大规模生产CDM。例如，胚胎干细胞在培养中通常被认为是长久的，间充质干细胞可以有13～25个群体倍增，表皮干细胞在衰老之前可以有多达115个群体倍增。然而，对于工业制造来说，维持干细胞来源是一项艰巨任务。细胞系或基因工程细胞由于能够长期维持，是大规模生产CDM的更好选择；然而，细胞系仍可能失去其特殊特性，需要定期进行质量控制和表征。此外，现有的扩增技术虽然解决了高表面积与体积比的营养转移问题，但是没有解决其他因素，例如动态培养的影响和下游加工的其他步骤。平台的动态特性（例如中空纤维生物反应器的灌注速率、微载体生物反应器的喷泡速率、滚筒瓶每分钟的转数、摇臂生物反应器每分钟的摇摆周期）将影响最终CDM产品的组成。因此，需要探索特定细胞与培养方式的固定制备体系。同时，大多数扩增平台是为提取细胞或生物制剂（如可溶性蛋白质）而开发的，不针对具有丰富不溶性大分子的整个ECM。因此，仍然需要开发特定下游工艺，以从现有系统中获取CDM（例如，从中空纤维通道、微载体或容器表面去除细胞）。总之，尽管仍然存在一些局限，但CDM因其突出的可调节性、安全性和高生物活性，在组织工程领域中显示出优越性。随着技术的不断进步，适用于临床的CDM支架将有望不断出现。
来源：中国修复重建外科杂志2024年11月第38卷第11期
(本网站所有内容，凡注明来源为“医脉通”，版权均归医脉通所有，未经授权，任何媒体、网站或个人不得转载，否则将追究法律责任，授权转载时须注明“来源：医脉通”。本网注明来源为其他媒体的内容为转载，转载仅作观点分享，版权归原作者所有，如有侵犯版权，请及时联系我们。)
