作者：张敏，张霓霓，李壮壮，张昊，遵义医科大学附属口腔医院颌面外科；黄桂林，遵义医科大学第五附属(珠海)医院
SS和头颈肿瘤
近年来学者们认为干细胞定植、迁移及归巢介导的修复再生作用主要是旁分泌因子生物学作用。细胞旁分泌组学(包括转录组学、蛋白质组学、表观基因组学)在唾液腺损伤修复领域得到了广泛的关注，唾液腺微环境中生物活性介质(如细胞因子、生长因子、调节因子、胞外囊泡等)在腺泡、导管细胞构成的唾液腺上皮细胞(salivary glands epithelial cells， SGECs)生长发育及修复过程中发挥重要作用，代表一种很有前景的“无细胞”治疗策略。本文就旁分泌因子在唾液腺细胞损伤修复中的相关研究作一综述，为SGECs再生和功能恢复提供可行的思路和靶点。
1. 旁分泌效应概述
生物体内细胞-细胞间作用方式主要分为化学突触传递神经信号效应，自分泌或旁分泌效应，内分泌效应，分别在组织修复及再生过程中发挥最基本的细胞通讯功能。2005年Gnecchi首次将Akt信号修饰、缺氧条件间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)收集的条件培养基(conditioned medium， CM)注射到诱导
学者进一步总结并将细胞分泌的细胞因子、趋化因子、生长因子、囊泡等通过细胞信号相互引导或重编程作用对临近或周围微环境中靶细胞发生时间-空间上生物调控的作用称为旁分泌效应。
1.1 旁分泌因子
常见的旁分泌供体细胞，如内分泌细胞、间充质干细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等，分泌释放VEGF、FGF、HGF、IGF、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor， PDGF)、神经生长因子(nerve growth factor， NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor， GDNF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMPs)和趋化因子等多种具有生物学活性的可溶性蛋白分子，统称为旁分泌因子。
细胞旁分泌因子以靶标作用方式激活细胞间的信号分子、受体和转录因子，其通过免疫调节、血管形成、抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗纤维化等多种生物学效应修复损伤状态的细胞，其在皮肤、脊髓、肾脏、肝脏、肺损伤以及心肌梗死、神经退行性疾病等组织损伤中显示出一定的“无细胞”修复再生潜力。
1.2 旁分泌微囊泡
细胞旁分泌组也通过其释放的胞外囊泡(extracellular vesicles， EVs)而发挥生物作用，就其异质性可分类为外泌体(exosome， Exo)、微囊泡(microvesicle， MVs)和凋亡小体。细胞旁分泌组中包裹着多种纳米级修复功能的微囊泡，作为最有治疗潜力的旁分泌介质，直接参与目标组织细胞再生，有望替代干细胞治疗应用于再生医学领域。
1.3 外泌体
外泌体由多种细胞释放，广泛分布于生物体液内，具有体积小、免疫原性低、载药量高和耐受降解等特点，通过内吞或膜系统融合方式与宿主细胞进行细胞间信号通讯，并识别B细胞表面组织相容性复合体Ⅱ类分子(major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ)进行抗原呈递等免疫代谢活动，也可携带原有干细胞的表观谱系和遗传信息，如传递miRNA、mRNA、lncRNA等在体液及细胞上清中介导靶细胞活化、遗传表型修饰、基因重编程等重要作用，从而影响受体细胞的生命转归过程。
2. 旁分泌效应促进SGECs损伤修复的机制
唾液腺形态发育主要依赖于SGECs的模式化和表型化过程，受其腺泡内部信号分子、受体及通路的严格调控。旁分泌效应在唾液腺发育微环境，如神经、脉管系统和细胞外基质(extracellular matrix， ECM)中发挥重要作用，其通过调控干细胞转分化过程、内源性干/祖细胞扩增、腺泡细胞抗凋亡作用、神经血管再生等机制参与SGECs(包括腺泡、导管、肌上皮和干/祖细胞)损伤修复和功能重建网络。
2.1 参与诱导干细胞转分化作用
多向分化潜能特性的MSCs通过基因重编程过程而转变为另一种特定成熟细胞并表达其功能特征，即转分化作用。体外共培养通过添加外源性细胞因子，如角质形成细胞生长因子(keratinocyte growth factor， KGF)、富血小板纤维蛋白因子(platelet-rich fibrin， PRF)可诱导牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells， PDLSCs)、脂肪干细胞(adipose-derived stem cells， ADSCs)转分化过程并产生具有表型及功能高度相似的腺泡样细胞。
除了外源性细胞因子外，旁分泌因子也可响应供体干细胞重编程、转录信号及表观遗传修饰参与调控邻近受损细胞的表型和功能。Mona等将骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)/SGECs培养基经液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-MS，LC-MS)高通量分泌组学分析，证实FN1、CYR61、FSTL1、AGRN、IGFBP7和LAMB2等信号蛋白诱导BMMSCs转分化为腺泡祖细胞，可能为关键的重编程因子。
Park等通过iTRAQ-2D-LC-MS/MS定量原代唾液腺细胞中旁分泌组，并用GO热图和KEGG通路筛选出Tcf3、Hmg20B、Ankrd56、Ptf1α、Ascl3和Mist-1等动态复合体可能是调控BMMSCs转分化为腺泡细胞的特定转录因子。Tran等通过分析唾液腺细胞外基质(SMG-ECM)的蛋白质组学，揭示富含亮氨酸蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan， SLRP)参与诱导CD133+表型修饰的BMMSCs转分化为唾液腺上皮细胞谱系，并表达PCR扩增产物，如
此外，参与胚胎、细胞发育的Notch信号也是干细胞转分化的关键调节因子，Notch信号转导的抑制会导致唾液腺发育不良。推测旁分泌因子激活该通路也可能增强MSCs转分化为腺泡细胞的效率，但尚待进一步证实。旁分泌因子可能参与干细胞转分化过程，从而代偿性补充机体因衰竭或损伤状态下代谢能力减退的腺泡细胞簇，但因存在原有MSCs基因残留表达、表观遗传缺陷，可能形成部分或混合性表型、功能的腺泡细胞，因此探讨旁分泌效应对调控MSCs转分化作用的机制将成为腺泡细胞损伤修复的重要方向之一。
2.2 促进内源性c-kit+干/祖细胞扩增
酪氨酸激酶受体(c-kit+)是一种干/祖细胞表面因子的锚定受体，不仅有助于干/祖细胞自我更新，并且是细胞增殖、分化、黏附、归巢、迁移和分裂周期等调控标志物。腺泡细胞代偿性增生与受损腺体内位于腺泡池、导管室中储备和“休眠”状态的c-kit+干/祖细胞的克隆扩增相关，仅需100～300个c-kit+即可分化为新的腺泡和导管样结构。旁分泌因子有效促进涎腺上皮中c-kit+祖细胞扩增及向腺泡分化的潜在途径。
Aure等证实腺泡周围的肌上皮细胞(myoepithelialcell， MEC)通过旁分泌FGF7靶向成纤维细胞生长因子受体2b(fibroblast growth factor receptor 2b， FGFR2b)从而激活丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)通路特异性扩增腺泡及导管远端kit+、Krt14+、SOX10+祖细胞群数量，并促进唾液分泌相关蛋白(Bpifa2、Lpo)表达。
Choi等将脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells， ADMSC)封装于(可注射的)猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa， SIS)基质水凝胶中，发现植入的ADMSC通过旁分泌效应促进唾液腺祖细胞(c-Kit+)、血管内皮细胞(CD31)和平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达，进而重塑辐射损伤SGECs。
此外，MSC-Exo及其载体信号具有启动干/祖细胞的修复和增殖功能，促进放射损伤微环境中腺泡细胞再生。Xiao等将低氧人尿源性干细胞(human urine-derived stem cells， hUSCs)来源的hUSC-Exos通过尾静脉注射至放射损伤小鼠模型，发现hUSC-Exos通过激活腺体内WNT生长发育通路诱导腺体中c-kit+干细胞/祖细胞表达和多能性WNT周期相关效应分子Wnt3a、GSK3β和Axin的表达。
Hayashi等发现胚胎第13天(E13)SMG培养基富集的外泌体通过上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)穿过上皮屏障，转运miR-133b-3p靶向调控DIP2(disco-interacting protein 2)信号介导的DNA甲基化，从而启动放射损伤腺上皮端芽中标记的c-kit+祖细胞扩增。
综上所述，旁分泌因子通过激活腺泡及导管上皮中固有休眠状态的内源性c-kit+干细胞/祖细胞，响应分化信号使其克隆、分化为代偿性腺泡细胞群。探索旁分泌效应对c-kit+干细胞增殖作用将有望解决唾液腺损伤环境下c-kit+干细胞数量缺陷，以此达到功能性腺泡修复或再生目的。
2.3 抑制腺泡细胞凋亡
腺泡细胞凋亡失调广泛存在于IgG4相关唾液腺炎、放射性唾液腺炎及
Kang等表明ADMSC通过旁分泌途径释放BMP6、转化生长因子β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)和Wnt2等信号因子抑制氧化应激介导的细胞凋亡作用，并激活WNT下游启动子(LEF/TCF)活性促进腺泡细胞进入修复周期。Lombaert等研究总结MSCs旁分泌VEGF、EGF、FGF2/7、GM-CSF等细胞因子，通过靶向激活腺泡内SHH和WNT等经典信号途径，进一步抑制辐射诱导的活性氧和脂质过氧化依赖的腺泡凋亡。
最新研究揭晓MSCs-Exo也与细胞凋亡机制密切相关，并通过抗凋亡机制参与腺泡细胞的损伤修复。Kim等将辐射诱导的人腮腺上皮细胞、人舌下腺上皮细胞、下颌下腺上皮细胞与ADMSC-EVs共培养后，发现凋亡效应因子Bax介导的启动因子(Caspase-9)和执行因子(Caspase-3)表达显著降低，并阻断细胞周期停滞基因(P21、P16)表达，从而减少腺泡细胞凋亡。
另外，Hu等发现牙髓干细胞(dental pulp stem cell， DPSC)来源的DPSC-Exos通过G蛋白偶联
2.4 促进血管重建和神经再生
分泌型腺泡单位的末端周围高度伴行着致密微血管网络并为其提供养分供应，研究表明旁分泌生长因子在维持腺体导管形态发生、控制唾液分泌功能以及重建微血管结构中起关键作用。Anderson等使用LC-MS/MS蛋白组学分析出BMMSCs-EXO具有多种促进血管生成作用的旁分泌因子，如FGF、EGF、PDGF增加血管生成的相关信号蛋白的表达。
Kwon等发现在腺体发育过程中，血小板-内皮细胞粘附分子(CD31+)标记的内皮细胞通过旁分泌胰岛素样生长因子结合蛋白-2(insulin-like growth factor binding protein-2，IGFBP-2)和IGFBP-3作用于导管前体细胞表面的血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)重建部分腺体血管网络，并促进导管分支形态发生。此外，Su等发现唇干细胞裂解液中血管内皮生长因子，如FGF-1、FGF-2、KGF、ANG、UPA、VEGF有效促进辐射后小鼠腺体周围微血管结构的形成以及唾液分泌功能恢复。
唾液分泌机制也与交感和副交感支配下神经元间的突触信号传导有关，旁分泌因子通过修复再生损伤的神经轴突、神经元来实现生理唾液的长期输出。腺泡细胞球培养微环境中神经营养因子促进孤立的副交感神经下神经节的神经突生长，减少了神经元凋亡，并增加辐射损伤小鼠腺体的端芽、祖细胞和神经支配的数量。
外泌体也参与唾液腺器官发生过程中神经轴突再生。有学者发现磁性生物(M3DB)组装的类器官(SGo)培养物中人牙髓干细胞来源的hDPSC-Exos促进放射损伤唾液腺球状体区室导管SGECs中干细胞扩增标志物(Ki67+、SOX2+)表达并通过信号素3A(semaphorin 3A，Sema3A)驱动网络微管蛋白β3(TUBB3)表达，促进轴突修复和神经元生长。目前对于神经和血管系统参与腺体再生的研究仍处于早期阶段，旁分泌因子在血运重建及神经再生的调控机制仍需进一步探索，对指导唾液腺损伤修复十分有利。
3. 旁分泌效应调控SS免疫稳态
细胞旁分泌因子具有调控特异性免疫细胞以及抗炎和促炎因子的活性，并通过传递信号分子靶向抑制损伤区域效应T、B淋巴细胞的活化、招募及聚集，从而介导宿主适应性免疫稳态，可为SS介导的SGECs损伤修复提供治疗新途径。
3.1 增强髓源性抑制细胞活性
髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell， MDSC)是一种由骨髓来源、未成熟的细胞集合，SS炎症损伤条件下对T、B细胞免疫应答起负性调节作用。BMMSCs通过旁分泌TGF-β激活经典TGF-β/Smad途径招募MDSCs对免疫T细胞的快速捕获。
Rui等发现嗅觉外充质干细胞(olfactory ecto-mesenchymal stem cell， OEMSCs)来源的OEMSCs-Exos携载S100钙结合蛋白A(S100 calcium binding protein A，S100A)受体识别SGECs释放Toll样受体4损伤信号激活JAK2/STAT3通路增强MDSC对T细胞免疫抑制功能。
Zhou等发现MDSC亲本来源的MDSC-EVs携载miR-10a-5p通过靶向SS病灶中B细胞激活因子来抑制抗Ro/SSA和La/SSB自身抗体产生，调控BCL-6转录因子阻止异位生发中心形成。外泌体在SS免疫应答过程中以靶向增强血液中循环MDSC细胞活性途径促进SS病理转归，为SS治疗研究提供了方向。
3.2 调控Th17/Treg细胞平衡
辅助性T细胞(Th)体系中Th17/Treg动态平衡的破坏是SS发生发展的重要病理因素。Th17是一种能表达CD4+的T细胞亚群，释放大量白细胞介素，如IL-6、IL-17、IL-21、IL-22促进淋巴细胞的招募和聚集，从而加剧SGECs损伤。牙髓干细胞条件培养基(DPSC-ECM)微阵列的空间转录组学揭示HGF、SIGLEC9、NCAM-1、NTF-3和BDNF因子通过抑制小鼠脾脏中调节性T细胞亚群(regulatory T cell，Treg)向Th17细胞转化，使Th17细胞数量及功能下降，有效改善SS病理进程。
Li等将唇腺干细胞(labial gland-derived MSCs， LGMSCs)来源的LGMSC-Exos经尾静脉注射SS小鼠模型，发现LGMSC-Exos通过调控CD4+T细胞亚群中Th17/Treg平衡，并诱导Th17转分化为Treg， 以此削弱促炎因子(L-17、IL-6、TNF-α、IFN-γ)释放，增强抗炎因子(TGFβ、IL-10)释放，重新建立SS免疫微环境稳定。外泌体作为Th17/Treg炎症调节器通过反馈性调控促炎及抗炎因子平衡在SS免疫稳态中发挥重要作用，但其相关信号调节机制需进一步阐明。
3.3 载体Exo-miRNA靶向调控免疫稳态
MSCs-Exo具有较好的生物稳定性和靶向活性，通过细胞间通讯并运载结合生物信息学、富集的关键微小RNA(miRNA)介导靶细胞信号传导网络改变。Kim等使用蛋白质组学和miRNA分子谱揭示了具有免疫调节作用的人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells， iPSCs)来源的iPSC-EVs中TGF-β1、miR-21和miR-125b影响SS免疫微环境。
Kakan等发现SS小鼠血清外泌体中高通量表达miR-127-3p通过辨认自身B细胞表面TGF-β受体，并调节有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activating protein， MAP)信号和BCL-5转录信号减少B细胞增殖、成熟与类转换。有学者发现根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla， SCAP)来源的SCAP-Exo表面MCH复合物通过抗原提呈作用识别并内吞CD4+细胞，转运hsa-piRNA-15254靶向胞质内IL-6R促炎信号，进而抑制IL-17和TNF-α分泌诱导的免疫失调。
Xing等研究表明LGMSC-Exos携载miR-125b与SS小鼠腺体内PR结构域锌指蛋白(PR domain containing 1，PRDM1)受体结合，靶向PRDM1信号途径抑制外周血中CD19、CD20、CD27、CD38膜标记B细胞亚群的过度活跃而产生的异常免疫反应。
值得注意的是，miRNA在SS免疫治疗方面也有负向调控效应，可作为SS的新的治疗靶点。Gallo等研究表明SS患者中EB病毒来源的miR-BART13-3p从B细胞转移到SGECs， 通过下调细胞内质网膜中基质相互作用分子1(stromal interaction molecule1，STIM1)表达并导致钙库操纵性通道(storeoperated， SOCE)介导的Ca2+信号障碍，减弱细胞分泌功能。Cortes-Troncoso等发现T细胞来源外泌体递送的miR-142-3p被SGEC效应细胞摄取，通过抑制Ca2+/cAMP信号轴下游蛋白(SERCA2B、RyR2、AC9)及环磷酸腺苷(cAMP)的活化级联反应而加重SS的炎症反应。
4. 预处理MSC增强旁分泌治疗效果
目前MSC旁分泌活性因子具有诱导腺泡修复及功能重建的潜力，但生物效应仍受各种外在因素的影响，如低氧、脱细胞ECM水凝胶载体、3D细胞培养、药物及机械诱导等预处理模式调节。因此，深入旁分泌因子及预处理MSC方法研究，有助于提高SGI修复治疗效果和临床应用潜力。
4.1 低氧预处理
缺氧诱导MSC表达更高水平的旁分泌因子，如GDNF、BDNF、VEGF、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管生成素(Ang-1)和基质细胞衍生因子(SDF-1α)及其受体CXCR4，这些血管神经素与腺体血管、轴突生长密切相关。最新研究表明低氧预处理hUSC-Exos、人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells， hAMSCs)来源hAMSCs-Exos较常氧
An等发现与PBS组相比，低氧培养hADMSC分泌组显著增加CD31和唾液腺祖细胞(c-Kit+)及α-SMA表达，并增加唾液分泌中AQP-5、EGF水平，促进唾液腺功能和结构组织重塑。
4.2 脱细胞ECM水凝胶载体
脱细胞ECM水凝胶具有腺泡细胞黏附、分化以及营养物质和氧气的定向输送的生理功能，可作为生物载体应用于唾液腺组织再生工程。研究证实与小鼠静脉单独注射DMEM培养基相比，乳牙干细胞水凝胶载体(SHED-ECM)中PDGF、锡酸钙素1(STC-1)、
Wang等制备猪来源的脱细胞ECM水凝胶(pDSG-gel)，通过LC-MS/MS蛋白质组学分析pDSG-gel微环境中分泌因子，如S100A6、CCL16、CCL28、FGF2激活PI3K/AKT信号通路促进下颌下腺间充质干细胞(submandibular gland mesenchymal stem cells， SGMSCs)的迁移和募集，形成功能性腺泡、导管样结构，并且有效抑制损伤部位纤维化。
4.3 3D培养微环境
三维(three-dimensional， 3D)球体因其致密性、高分泌等生物学特性，能更好地模拟细胞在体内的生理功能，研究表明，3D培养球体的腺泡细胞表达较高的淀粉酶(α-AMS)、紧密连接蛋白和胞质内Ca2+浓度水平，并维持细胞与细胞间上皮极性和生长分化。
另外，3D培养条件可增强唾液腺体内驻留干细胞SGSCs旁分泌功能，Shin等发现体外培养的3D-SGSCs微球载体通过激活腺体内WNT信号通路增强自身表面干性标志物(POU5F1、SOX2+、LGR5、THY1)表达，并促进BDNF、GDNF、EGF、HGF和IGF1等生长因子表达，这对治疗放射诱导的唾液腺功能减退是有益的。
4.4 机械诱导
动态机械分子可将细胞微环境中的生物力学信号整合并转化为细胞内的生物化学信号；Xia等研究显示ECM机械力感受分子PIEZO2通过Ca2+/ERK1/2/KLF2信号通路激活耳蜗祖细胞(CPC)整合素α3(ITGA3)、F-actin骨架蛋白、Yes相关蛋白(YAP)等机械转导信号，促进CPC衍生的上皮类器官的扩张，以此驱动感觉上皮的形成。
此外，最新研究表明YAP是Hippo通路的关键效应因子，其通过YAP定位的激酶基因(Lats1、Lats2)调控腺体导管祖细胞(Krt5+/Krt14+)的扩增、自我更新和分化途径，可能为机械传导信号在唾液腺腺体导管修复再生研究提供了新思路。
5. 总结与展望
目前旁分泌活性因子(包括细胞因子、趋化因子、生长因子、微囊泡、外泌体)在唾液腺损伤修复中扮演重要角色。旁分泌效应能够诱导腺泡细胞的转分化、干细胞/祖细胞扩增、抗凋亡、神经血管再生作用以及调控炎症免疫反应，其靶向治疗效果在不同层面的实验研究中都已有所彰显。
然而，旁分泌因子在靶标受体部位的持续释放和高效保留、纯化问题及旁分泌信号对细胞内修复性通路(如PI3K/AKT、MAPK、ERK、TGF-β、SHH、WNT、NOTCH等通路)激活方式尚未明确，仍需开展大量基础、临床实验探索。因此，今后通过探索预处理模式，包括缺氧、炎症微环境、3D细胞培养、化学制剂及机械诱导的细胞衍生的旁分泌因子或外泌体及载体miRNA研究为针对性突破口，优化基于旁分泌调节的无细胞疗法。
来源：张敏,张霓霓,黄桂林等.旁分泌效应在唾液腺损伤修复中的研究进展[J].临床口腔医学杂志,2024,40(03):185-190.
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