作者：广西医科大学第四附属医院手足踝外科 邓海林
肠道菌群DNA可在骨关节炎和类风湿性关节炎患者的滑膜中找到，这一发现可能是由仍然存活的细菌经血液途径由肠道迁移至关节所造成，因为在健康人体血液中的多种休眠微生物群是可以在体外短暂复苏的。近年来有研究报道，骨关节炎和对照组的软骨中肠道微生物组成分存在差异，结果表明来自肠道微生物群中死亡或活的细菌在肠和骨骺骨髓之间存在类似生理上的迁移行为。软骨下微生物群可以促进软骨愈合，并在具有免疫抑制特性的代谢物中转化深层软骨基质成分。无论是骨关节炎患者还是对照组，观察到的髋关节和膝关节软骨之间微生物组的差异，可能是软骨细胞代谢的细微差异的对应物，与他们本身在不同关节的DNA甲基化差异一致。虽然理论上细菌不能穿过有完整骨骺板屏障到达关节软骨细胞，但是一些细菌可进入到幼年动物未闭合骨骺中的血管通道，而其他情况是在体外实验中发现有关节软骨细胞被细菌感染的表现。在骨关节炎早期骨软骨板血管生成可进一步增强微生物群靠近定植更深软骨层的能力，这可能会导致局灶性生态失调，轻度炎症，软骨退化，软骨细胞的表观遗传改变和恶化骨关节炎。需要更多基于不同种族、体重和年龄的软骨研究，以证实存在于接近软骨层的肠道菌群，以利于更好地理解其生理性和病理性意义。
微生物群导致骨关节炎发病机理
骨关节炎（OA）可能是一种进化不良性疾病，在当今社会更为常见，由于遗传基因无法或者不能完全适应现代环境条件的改变，包括体力运动缺乏和饮食变化导致肥胖以及代谢综合征。值得注意的是，所有这些条件与肠道微生态菌群变化有关，而一项Meta分析报道自城市化和前农业化的人类肠道微生物群表明，人类近代史上发生的城市化/工业化进程通过获取和/或失去特定的肠道微生物来塑造肠道微生物群。这些肠道细菌是否会对软骨产生毒性尚未得到证实，但是一些实验证据表明微生物群对OA的影响。例如，在无菌小鼠中进行膝关节内侧半月板不稳定造模诱导成骨关节炎的数量减少。软骨损伤（周期性压缩载荷造模引起)在同样服用慢性抗生素以预防代谢综合征的小鼠中也同样减少，这表明肠道微生物组可能影响软骨病理。有研究发现个体肠道微生物组分类与髋、膝关节OA之间存在明显相关性。此外，已经证实肥胖和OA之间的联系，甚至在非负重的上肢关节中也会发生OA。
近年来，国内在肠道微生态与OA之间的相关调控关系进行了前沿研究总结：肠道微生态系统作为全身炎症系统反应库，该系统失衡将引起全身炎症反应改变、多种代谢综合征，进而导致关节软骨的代谢紊乱。目前提出以下几种假说解释这些发现：代谢综合征自身伴随的肠道菌群失调可能促进OA，因为在饮食诱导肥胖的动物模型中更易形成OA，更多的与体脂有关，而并非体重；在实验小鼠中，肥胖与肠道中有益菌（双歧杆菌）损失增多相关，而关键的促炎介质大量增加，导致巨噬细胞增多迁移至关节滑膜，加速膝关节退行性改变形成OA；肥胖与肠道黏膜免疫屏障能力降低、微生物群易位和血清脂多糖升高相关。这种易位诱导的低级别炎症可通过Toll样受体-4启动关节的促炎性先天免疫反应，全身及滑膜细菌脂多糖浓度与关节炎症反应及关节降解的严重程度呈正相关（骨赘评分，关节间隙狭窄）。
有研究解释可能是类似的肠道菌群移位发生在软骨下骨及骨髓和/或更深的软骨区，可直接导致OA的变化。这可能是通过扰乱软骨代谢，即肠道微生物群通过其参与宿主生理活动，而生理活动代谢产物和某些代谢物可能对于软骨有毒性损伤，或者通过逐渐诱低度炎症和/或导软骨细胞和软骨下骨及骨髓细胞的外观变化。这种肠道菌群向软骨下骨及骨髓的短暂易位可能也有助于解释OA骨质损伤病灶现象。本综述是一叙述性的评论，旨在从近期的文献中归纳论据或证据支持这一假设，即软骨附近来自肠道微生物群中死亡或活的共生菌的易位可能有助于解释动物和人OA的某些发病机制。为此，文章检索2023-01前在Medline、中国知网、万方、重庆维普收录的相关文献，并使用以下关键词检索此主题：“osteoarthritis”or“cartilage”or“chondrocytes”AND“microbiota”or“dys⁃biosis”or“bacteria”or“commensal”or“translocation”or“trafficking”or“migration”or“blood”or“vascularchan⁃nels”；“骨关节炎”或“OA”或“关节软骨”或“软骨”而且“肠道微生态”或“益生菌”或“细菌”或“血管通道”。
转运微生物DNA到关节不是例外而是存在规则
在最近的一项研究中，卟啉单胞菌和拟杆菌DNA在所有183例风湿性关节炎样关节炎或OA患者的滑膜或滑膜液中均可检测到。其中一些微生物细菌的DNA在类风湿性关节炎滑膜组织中含量更丰富，而其他成分则在OA滑膜组织中含量更丰富，而且在每种条件下，从相应的滑膜液提取的细菌DNA成分不同。目前尚不清楚这些核酸来源于免疫细胞（例如巨噬细胞）从粘膜或细菌中转移到达关节时是否仍然存活。
健康人的血液不是完全无菌
最近一项研究对来自30名健康献血者的全血的16S靶向宏基因组通路测序，观察到健康血液中存在多样化的微生物组。在门水平上，血液中大部分细菌DNA来自变形菌门（超过80%），但也有来自放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。大多数血液细菌DNA位于黄褐色被毛中（93.74%），红细胞中含有的细菌DNA（6.23%）比血浆（0.03%）多得多。这些发现证实了先前使用透射电子显微镜所做的观察。这些细菌可能部分已经死亡，但其他细菌可能只是处于休眠状态。事实上，一些学者最近声称这种血液微生物群（细菌和真菌）可以通过使用高浓度的维生素K并将细菌在43°C下保持至少72h而复苏。有研究报道28例健康人血液样本30d后全部培养阳性，革兰氏染色和透射电镜也证实，细菌目以变形菌门为主。然而，这种微生物群可能倾向于保持沉默，因为在继代培养中，这种血液微生物群恢复到休眠状态。与粘膜一样，这种血液共生微生物群的生理环境之一可能是保护宿主免受血液和/或内皮细胞中毒性更强的细菌的侵害。虽然这种短暂的复苏尚未被复制，但是肠道微生物群中的活细菌到达软骨的可能性值得被关注。
肠道微生物组最近在人类软骨中被发现
采用无菌原则程序，软骨取自原发性OA膝关节和髋关节置换术，并且OA侵蚀软骨和完整软骨均进行标本采集。无骨性关节炎患者软骨标本提取自30具性别、年龄和体质量指数相近的新鲜尸体。所有样品采用IlluminaHiSeq进行16sRNA基因深度测序。在一个单独的确认队列中，用分支特异性qPCR证实了组OTU差异（10个侵蚀样本，10个完整样本，10个对照样本）。在分组分析中，OA与对照组之间有63个支系差异。OA组以β变形菌属为主，而对照组以放线菌属和梭菌属为主。试验观察到一个改变：OA向革兰氏阴性成分DNA转变。同时，髋关节OA和膝关节OA之间也存在显著差异。髋关节OA微生物群以变形菌门为主，而膝关节OA微生物群以放线菌门为特征。同样，膝关节对照组与髋关节对照组有46个差异。一项对OA肩关节的研究得出了相反的结论，因为在严格去除污染后，在74%的肩袖肌腱组织样本中只能鉴定出各种不动杆菌和草酸杆菌科的基因组DNA，而在肱骨头软骨中却没有。虽然这些发现还需要证实，但以变形菌门为优势菌群的特征（至少在髋部标本中）将与研究血液微生物组时所获得观察结果一致。β-变形菌在OA软骨中的优势也符合在观察代谢紊乱综合征患者中的观察结果：不稳定肠道微生物群落的标志-变形菌门丰度增加。
微生物群DNA或肠道细菌如何到达软骨层
目前还没有研究表明这种DNA是否储存在软骨下骨及骨髓、深层软骨血管、软骨基质或软骨细胞本身。这些DNA（可能微生物群中还有活细菌）是如何到达软骨的尚不清楚。与大多数组织不同，关节软骨在浅、中、深层区域没有血管、神经或淋巴管，因此关节软骨的大部分营养是通过滑膜液和软骨下骨及骨髓的扩散来实现的。软骨基质依据渗透物大小、电荷和分子结构来限制渗透作用。据估计，软骨细胞外基质内的平均孔径约为6.0nm，而大多数细菌的大小范围约为100~4000nm，细菌孢子大小约为100nm。因此，细菌渗透通过软骨表面区域似乎是不太可能的，除非软骨表面发生大面积的侵蚀。同样的道理也适用于细菌DNA，因为另一个原因，即只有带正电荷的物质才有可能促使其自身在软骨基质内的聚集，即使是中性分子也不能在软骨中扩散，然而DNA是呈负电荷的。这适用于大多数细菌，因为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞壁带有负电荷。相反，钙化的软骨可渗透小溶质，而且软骨下循环对深层软骨具有重要滋养作用。在核心区域的钙化区，大量的恒定区软骨是通过血管通道进行营养代谢的。此外，骨性关节炎的骨软骨连接处显示新生血管生成。
值得注意的是，细菌可以粘附于生长区软骨，阻碍猪和鸡软骨的血液供应。细菌也可在患有感染性关节炎/骨髓炎的小马（马驹）的软骨管中观察到，而急性或慢性感染的软骨管与关节-骨骺软骨复合体的缺血性软骨坏死有关。微生物群的病理复制同样可以造成一些生长软骨缺陷，如在鸡胚中，暴露于微生物来源的脂多糖通过提高Sox9的表达抑制软骨形成，并延缓生长板中软骨细胞的生长增大。由于成人血管通道持续存在（包括在某些部位，如鼻、甲状软骨和肋软骨，由于这些部位软骨不能得到滑膜滋养成为多软骨炎复发的靶点），其可能促进这些部位和软骨下骨及骨髓的血液微生物群的易位。在成人血管通道内短暂存在的非致病性细菌迄今尚未见报道，但来自肠道微生物群的细菌可能在靠近软骨深层区域的软骨下骨及骨髓内以潜伏状态持续存在，因为在那里发现了和肠道一样的厌氧代谢。这种短暂的入侵甚至可能发生在出生前，因为在健康血液和软骨中发现的肠道微生物群的主要亚群变形菌是正常、健康的胎盘微生物群的一部分。在人骨骺骨髓中寻找肠道菌群的另一个原因是共生菌群对人体骨骼代谢的影响（抗合成代谢和促代谢作用），这类作用在小鼠模型中似乎是通过介导局部破坏胰岛素样生长因子-1信号造成。
细菌是否能感染软骨细胞
一些研究甚至提出了细菌感染软骨细胞的可能性：滑膜支原体，一种主要的家禽病原体，可以在体外侵入原代鸡软骨细胞。滑膜分枝杆菌上调了这些软骨细胞中的基因表达，包括编码肽精氨酸脱亚胺酶Ⅲ型的基因表达，该基因负责蛋白质的翻译后瓜氨酸化。在人类中，牙龈卟啉单胞菌可以在体外粘附并感染原代人软骨细胞，增加细胞凋亡，部分是通过细菌的磷酸甘油二氢神经酰胺脂质实现。一些菌株化脓性链球菌也可侵入软骨细胞，导致基质金属蛋白酶-13的极度高表达和细胞外基质的降解。然而，必须强调的是在体内这种感染仍然仅仅是假设，尽管在15年前被蜱虫叮咬后出现扩大的红斑病变的患者中，自体软骨细胞移植修复软骨缺损后观察到急性螺旋体关节炎。通过PCR在移植关节的滑液中检测到伯氏疏螺旋体DNA序列，并通过培养伯氏疏螺旋体证实了诊断，表明该细菌在移植软骨细胞中休眠了15年。
在正常的软骨下骨及骨髓中肠道菌群是否具有生理作用
Dunn等报道在研究的人体软骨样本中发现了肠道微生物群，其根据关节的不同而不同，这意味着这些细菌在软骨中的存在不是随机的，尽管数量非常少，状态稳定，但是可能起着生理作用。例如，其能够将深层软骨基质中的某些成分转化为具有免疫抑制特性的代谢物，这可能是其意外出现在软骨附近的原因之一。微生态菌群的成分还通过免疫细胞的成熟和分化影响肠道的免疫系统。近期有研究表明，硫酸软骨素二糖（抑制变形菌的生长）可能是产丁酸的底物，当添加到小鼠的饮食中时，在健康和应激条件下，总短链脂肪酸和丁酸水平都有所增加。同样，来自鲨鱼软骨的硫酸角蛋白对小鼠肠道微生物群也有很强的影响，并诱导乳酸杆菌丰度急剧增加（雌性小鼠为16倍，雄性小鼠为2倍），这是总短链脂肪酸产生的重要群体。虽然目前只在肠道中观察到，但假设生产微生物群埋入靠近透明骺软骨深层区骨髓血管内的总短链脂肪酸（因此暴露于适当的底物，如硫酸软骨素或硫酸角蛋白）同样可以维持一个耐受性生理状态，以保护造血和骨髓基质干细胞免受过度免疫反应的影响。另外，在软骨边缘、靠近骨髓陷窝的地方存在微生物群，可能是异位肠道微生物群的固有特性，可以抑制致病菌的扩张。事实上，这些“自我细菌”可能起到了雇佣兵的作用，以避免种植更危险的微生物种，导致在组织中有过度适应性免疫反应而引起不适。最后，肠道微生物群中的某些细菌具有促进软骨愈合的潜力。事实上，与未愈合的小鼠相比，MRL/MpJ小鼠（基本上不发生创伤后OA，这是一种与耳朵伤口愈合能力密切相关的特征）的肠道微生物群组成存在实质性差异。此外，软骨的愈合特性可通过肠道菌群移植的方式部分转移到非愈合性B6小鼠，而这与一些肠道微生物类群的变化有关。
肠道细菌如何影响OA患者的软骨
在OA早期发生的骨软骨板血管生成可以促进仍然存活的细菌或其产物的短暂迁移，直到更深的软骨层。在一项对431例膝关节患者的研究中，OA、基线脂多糖结合蛋白、基线脂多糖结合蛋白的时间积分浓度与恶化关节间隙宽度和狭窄程度相关，即使在调整治疗组、年龄、体质量指数和基线放射测量后也是如此。可溶性TOLL样受体-4水平也与16~18个月后的膝关节OA进展程度相关。软骨深层中过量的微生物抗原可能会促进轻度炎症和软骨降解，就像病原细菌抗原一样，如包柔氏螺旋体通过整合素alpha3beta1与人软骨紧密而持久地结合，可以刺激人软骨细胞中原代促炎介质的产生。软骨下骨及骨髓微生物群病原菌迁移引起的局灶性失调也会影响软骨细胞的表观遗传，因为微生物代谢物可以诱导一些人类细胞的表观遗传修饰，即DNA甲基化和microRNA表达的变化，如肥胖患者所体现的一样。有研究提出肠道和自主神经通路作为神经内分泌和肠道衍生因子为这种关系提供输入，通过抗炎和促炎作用进一步改变骨生理。一些促进骨性关节炎软骨细胞炎症反应的LncRNA，如miR-671-5p，可抑制正向调节软骨细胞炎症递质分泌；通过表达LncRNADLEUl能够靶向下调miR-671-5p的表达促进软骨细胞炎症递质的分泌。
髋关节和膝关节软骨中观察到的微生物群差异，无论是OA患者或对照组，在不同关节中软骨细胞代谢和DNA甲基化的差异可能相符
髋关节和膝关节软骨不完全相同：全基因组DNA甲基化检测了31对完整的和受损的软骨样本（14对膝关节和17对髋关节），这些样本来自因原发性OA而接受全关节置换术的患者。不考虑骨性关节炎的病理生理，两个关节之间共有6272个CpG二核苷酸存在差异。在不同甲基化区域，膝关节和髋关节的关节软骨之间一致的基因表达差异标志着HOX基因之间的转录组差异。另一项研究证实了髋关节和膝关节软骨细胞甲基化谱的主要差异，该研究提出无论髋关节或膝关节OA甲基化谱聚集分为两组。同时分析认为髋关节和膝关节正常软骨和OA软骨的细胞DNA甲基化与微生物群组成将是必要的，以评估微生物群的变化是否与髋关节和膝关节软骨中不同甲基化基因簇以及不同关节的代谢差异相关。
总结
近年来，大多数临床医学生被教导只考虑菌群生长后需要应用抗生素。因此，许多医师仍然对微生物群视而不见，认为其要么是粘膜中可以忽略的无害细菌，要么是在其他组织中发现的污染。多西环素治疗膝关节和髋关节骨性关节炎的临床疗效不佳，尽管关节间隙狭窄明显减缓，也加强了细菌参与骨性关节炎和其他软骨疾病发病的机制。事实上，抗生素会加重而不是改善肠道内环境失调，如果能确认在正常的软骨深层附近或内部存在肠道微生物群，将是对OA至少部分亚群认识的一场革命，包括与代谢综合征相关的。由于骨性关节炎在老年女性中更为常见，因此根据性别和年龄寻找粪便和软骨的差异将是更有研究意义的方向。尽管性别对肠道菌群的影响似乎没有其他因素那么大，但是大多数动物和人类研究都表明，肠道菌群存在与性别相关的差异。年龄也会引起肠道微生物群的变化：一项关于老年人粪便的横断面研究中对367名健康的日本受试者（0~104岁）采用分层Ward’s连锁聚类分析，发现肠道菌群组成随年龄变化的一些模式和过渡点，共鉴定出5个聚类，年龄中位数为3岁（0~35岁）、33岁（24~45岁）和42岁（32~62岁）、77岁（36~84岁）、94岁（86~98岁）。关注于运动和饮食对关节/软骨微生物群的影响也应具有指导意义。运动和饮食可以改善人类和小鼠的肠道微生物菌群，这也可能转化为关节和软骨内部反应的改善。因此，迫切希望进一步研究不同种族、体质量指数、关节、年龄、运动、饮食甚至聚糖组成的软骨微生物群和微生物，首先证实以上这些方面微生物群的差异，然后扩展人体软骨中肠道微生物群的初步发现，这似乎在对照组和OA中有所不同。
来源：中国骨与关节损伤杂志2024年8月第39卷第8期
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