作者：山西医科大学第二医院骨科     卓雨豪

关节软骨缺损常由创伤、退行性病变、剥脱性骨软骨炎等导致，由于关节软骨缺乏血液供应，损伤往往难以自行修复，并进展为骨关节炎。对于不适合进行关节置换，特别是存在局限性大面积软骨缺损的年轻患者，同种异体骨软骨移植（OCA）是一种解决方案。OCA手术通过将同种异体骨软骨移植物（OCAs）移植至患者关节的缺损部位，为其提供即刻的力学支撑，恢复软骨表面的光滑度和承载能力。

OCAs因为其结构和免疫特性，适用于许多关节疾病，包括复杂的重建手术、软骨缺损或其他软骨修复技术失败后的二次治疗。据估计，目前美国每年进行超过4900例膝关节OCA手术，临床效果令人满意。由于OCA手术以软骨替代为基础，因此移植时软骨的健康非常重要。为了延长移植物在宿主体内的存活时间并维持正常的生理功能，OCAs在植入时需要具有至少70％的软骨细胞活力。考虑到细菌污染和传染病的风险，美国组织库协会推荐并规定了现行的组织库协议，要求新鲜移植物在投入使用前被保存至少14d，以便完成微生物和血清学检测。然而，随着保存时间的增加，OCAs的软骨细胞活力持续降低，当保存超过28d后，低活力的软骨可能不再适用于手术移植。选择合适的保存方法，可以延长OCAs的保存时间，为OCA手术提供更多的可用供体，因此，本文综述OCAs的不同保存方式，为其临床应用提供参考。

OCAs的冷冻保存

20世纪60年代，Curtiss等和Herndon等的研究发现，冷冻保存可以降低OCAs的免疫活性，从而降低排斥反应。当时，临床医生们将刚获取的移植物置于无菌瓶中冷冻（－70～－20℃）保存，手术前在抗生素溶液中解冻后进行移植，术后的结果令人鼓舞，大部分患者在术后6个月到2年内恢复了良好的运动功能。到20世纪末，尽管新鲜骨软骨移植物已经被证明是有效的，但由于供体短缺，仍需要使用冷冻移植物。当时的方案是：将组织暴露于冷冻保护剂（CPAs）后，迅速降至超低温保存，直到用于移植。

遗憾的是，即使添加二甲基亚砜等低温冷冻保护剂或是采用控制速率降温的方式，都会导致移植物内的细胞活力接近完全丧失，且软骨细胞的存活仅限于软骨基质的表层。由于软骨细胞负责维持细胞外基质，冷冻保存移植物的软骨基质会随着时间的推移而恶化，在术后5年，几乎所有的小块移植物都没有存活的软骨细胞，基质也出现破坏。

Muldrew等在研究中发现，采用阶段冷却的方案可以显著提升软骨细胞的存活率。通过在－4℃、－8℃和－40℃保持特定的时间，随后浸入液氮（－196℃），能够使解冻后的软骨细胞存活率达到（62±13）％。随后的长期观察研究显示，尽管大部分软骨细胞在刚复温时看似存活，可冷冻过程中造成的软骨结构破坏、渗透变化和凋亡介质的产生，会在移植术后产生长期的负面影响。此后，为了提高保存效果，研究者们进行了许多关于移植物冷冻方法的研究。遗憾的是，冷冻移植物在复温后始终无法达到可接受的软骨细胞活力。软骨组织似乎已经被证明无法使用传统冷冻方法进行有效保存。

OCAs的玻璃化保存

21世纪初，玻璃化保存法为移植物的长期保存带来了希望。玻璃化是指物质在冷却过程中，从液态直接转变为非晶态固体的过程。通常软骨的玻璃化程序包括：预处理、冷冻保护剂的加载、快速冷却后存储。OCAs的玻璃化保存，即通过加载高浓度的CPAs和快速冷却技术，以完成软骨组织的玻璃化，这个过程避免了冰晶形成对细胞和基质结构的破坏，最大程度上保护了软骨基质与细胞活力。2010年，Brockbank等在一项研究中对新鲜的猪骨软骨组织进行了玻璃化处理，并以刚获取的新鲜猪软骨作为对照。当使用改进后的VS83配方（不同浓度二甲基亚砜、甲酰胺和丙二醇的混合物）进行玻璃化后，2mm、4mm、6mm厚度移植物内的软骨细胞存活率分别为80．7％、55．5％和43．6％。尽管初步的研究结果十分令人欣喜，但考虑到保护液的渗透性能以及安全性，研究中的玻璃化方案还远未达到临床上对于人骨软骨移植物长期保存的要求，特别是在保存较厚移植物时。

目前，实现临床OCAs玻璃化保存的两个最大障碍就是CPAs的毒性和渗透速率。在快速降温前，需要将组织浸泡在含有高浓度冷冻保护剂的溶液进行加载，以防止降温时细胞内冰晶形成，而高浓度的CPAs溶液在很短时间内就会对软骨细胞产生毒性。通过优化CPAs溶液配方或提高保护剂渗透效率以降低加载时间，减轻对软骨细胞的毒性作用，能够有效解决这一问题。

CPA的毒性作用     为了探究不同CPA的毒性，Jomha等在猪关节软骨上开展了相关研究，研究人员分别将猪的关节软骨暴露在不同浓度的CPAs溶液中5min或120min，通过膜完整性染料和代谢活性检测评估五种常用的CPAs（二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油和甲酰胺）的毒性顺序及其相互作用。研究表明，在1mol／l的浓度下，所有溶液在5min和120min的暴露时间内毒性均较小；而在3mol／l的浓度下暴露120min后，乙二醇和甘油相对于其他CPAs显示出较低的毒性；研究结果也表明，冷冻保护剂的组合使用比单一CPA的毒性更低，验证了不同CPA之间毒性的相互影响。在使用人软骨为对象的CPAs毒性研究中也展示了类似的结果。通过选择具有良好毒性相互作用的CPA组合，可以降低CPA溶液对软骨细胞的毒性。

CPA对软骨的渗透速率     由于软骨组织特殊的结构和较低的细胞密度，渗透速率对玻璃化的成功与否有显著影响。软骨细胞分布在致密的胞外基质中，这可能会减慢CPAs的扩散速度。因此，优化渗透速率以确保CPAs在不损伤细胞的同时能够有效渗透到组织中，是成功实现软骨组织玻璃化的关键。Ｚhang等研究了在不同温度下，二甲基亚砜对羊关节软骨的渗透速率变化。结果表明，在阶段降温过程中逐步增加CPAs浓度，能够有效降低低温保护剂的加载时间和由此产生的毒性作用。Shardt等的研究团队探究了冷冻保护剂在软骨中的渗透和流出速率，并提出了一个优化方案。理论上，该方案能够在保持成功玻璃化所需的最低CPA浓度的同时，将总体时间从9．5h缩短至7．0h。几年后，该团队通过计算冷冻保护剂浓度、溶液玻璃化能力和冰点的空间、时间分布，提出了新的设计方案，包括降低冷冻保护剂浓度、去除甘油并引入平衡步骤，以提高软骨细胞活性和代谢能力，并维持胶原蛋白表达。

载体溶液的影响      载体溶液是玻璃化过程中的另一个关键组成部分，它通常包含营养成分，如生长因子和抗氧化剂，能够支持细胞在冷冻和解冻过程中的生存；其黏度、PH值和离子组成，也影响着CPAs的渗透速率。通过优化载体溶液的选择，可以显著改善软骨细胞的保护效果。Stadnyk等的研究中评估了使用不同载体溶液对移植物进行玻璃化后软骨内细胞活力的变化。实验比较了磷酸盐缓冲液、Dulbecco’s改良Eagle’s培养基（dmem）、Ｘ－vivo细胞培养基和通用细胞活性保护液（UCV）四种载体溶液的保存效果，并测量了玻璃化过程中的PH值。结果表明，使用UCV作为载体溶液能够显著提高软骨细胞的活力，尽管溶液中存在PH变化，但并未发现PH参数与细胞活力之间存在显著相关性。

在冷却和升温过程中，组织内部产生的热机械应力可能也是一个需要考虑的因素。Wu等使用二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇，通过优化的7h冷冻保护剂渗透方案，研究了组织周围有无玻璃化溶液两种情况对移植物冻存效果的影响。结果显示，去除软骨周围的玻璃化溶液更有利于保持软骨细胞的活性和减少软骨损伤。这可能是由于在去除周围玻璃化溶液后，软骨组织经历了更快、更均匀的冷却和升温过程。此外，Wu等还讨论并验证了软骨素硫酸盐和抗坏血酸作为添加剂对软骨细胞存活率的积极作用。

玻璃化软骨的机械性能     力学因素在移植后的软骨功能维持中起着重要作用，但目前关于玻璃化对软骨力学性能影响的研究较少。研究人员通过对新鲜、冷冻和玻璃化处理的猪关节软骨进行力学加载，获得不同实验组的峰值模量、平衡模量和松弛时间常数。结果表明，玻璃化处理后的猪软骨的力学性能与刚收获的新鲜软骨相近，并且优于保存21d后的新鲜软骨。这些结果表明了玻璃化能够很好地保持细胞活力，并维持软骨的机械性能。

OCAs的新鲜保存

新鲜骨软骨移植物内的软骨细胞和基质是最接近生理状态的，尤其是细胞活力，这对于移植后长期的软骨功能维持至关重要。尽管存在保存条件严格和移植时间窗口短暂等限制，新鲜移植物仍是OCA手术的最佳选择。研究者们希望通过对保存条件进行优化，延长新鲜移植物的保存时间，以缓解供体短缺的情况。

温度     新鲜软骨的保存温度决定了软骨的代谢状态，这是影响保存效果的关键因素。考虑到保存成本和移植物污染风险，组织库通常将OCAs储存在1～10℃的冷藏环境中。根据现有的研究，生理温度（37℃）下或许能更好地保存细胞活力并维持基质含量。Pallante等使用成年山羊的骨软骨样本，分析了在不同温度下储存28d后的软骨细胞活力和基质含量。结果发现，在37℃储存28d的样本，软骨表面的活性约为80％，中层约为70％，显著高于4℃储存样本的活性。此外，无论是在37℃还是4℃储存的样本中，软骨的厚度、糖胺聚糖含量和胶原蛋白含量与新鲜对照组相比都得到了维持。因此作者建议，使用37℃储存延长OCAs的保质期，可以提高移植物的可用性，并可能改善临床治疗效果。随后的一项研究结果也支持这一观点。

在2012年，Stoker等提出了一种改进的OCAs保存方法，通过使用特定的培养基和容器，能够在25℃下将OCA组织保存长达63d。2年后，Cook等报道了一种名为密苏里骨软骨同种异体移植保存系统（MOPS）的新型保存方法，即在室温（约22～25℃）下使用特定的无血清介质进行保存，并在犬模型中与4℃的标准组织库方案进行了比较。相比于4℃，MOPS能够显著提高第60天时的软骨细胞活力，并在植入后6个月的评估中，无论是在细胞活性、组织学评分还是生物力学方面，MOPS保存的骨软骨都显示出与4℃保存相当或者更优的结果。Nover等和Stoker等在随后的研究中验证了MOPS的保存效果，室温下的MOPS保存的OCAs质量明显要高于4℃保存的标准组织库协议。研究还通过连续的细菌学检测，证明了在室温（25℃）条件下储存的样本，其污染风险比4℃更低，尽管这个数值在统计学上并没有意义。但是，这表明在无菌条件下，温度的升高并不会带来额外的污染风险。研究还发现，使用MOPS进行保存，新鲜软骨在获取后至少56d内保持最初的细胞活力水平，且更换培养基对细胞存活率并无影响。然而，Denbeigh等在2021年报道的研究似乎否定了室温保存的观点。由于已经有相当多的证据表明4℃储存后软骨细胞活性降低，于是作者使用人软骨进行研究，比较了在室温（22℃）和生理温度（37℃）条件下所储存软骨的细胞活力。为了模拟关节腔的封闭环境，研究者设置了正常氧含量组和低氧组，以及更换或不更换保存溶液组，并统一使用了无任何添加剂的无血清培养基。研究结果显示，在37℃下经过7d的保存后，无论是正常氧还是低氧条件，细胞活力都在90％以上；而在室温保存下，软骨的平均活力仅有66％，甚至低于70％的最低值。作者还强调了他们在22℃储存的样本中观察到了巨噬细胞／单核细胞生物标记物CD163的表达增加，这表明了在亚生理温度下软骨内炎症反应的发生。此外，从4℃或22℃恢复到生理温度，无论复温过程快速或缓慢，都会对软骨细胞的代谢活性产生一定程度上的抑制。

保存溶液    组织库根据储存对象的不同，选用不同配方的保存溶液，尽管目前对于骨软骨的保存溶液没有统一的标准，但大体上都是在标准无血清培养基的基础上对配方或添加剂进行优化。历史上，乳酸林格氏溶液是短期移植物保存的首选溶液，但这种等渗溶液缺乏帮助维持组织细胞的营养物质。含营养物质的储存介质可比单独的乳酸林格氏溶液更有效地维持细胞活性，例如DMEM，是一种广泛使用的水基合成细胞培养基，包含有无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素和缓冲系统以及抗氧化剂的浓缩混合物。Ball在研究中发现，移植物在乳酸林格氏液中储存7d后，软骨细胞的存活率和代谢活性显著下降。相比之下，培养基提供了更好的软骨保护，即使在储存14d时，细胞活性和代谢活动与保存前相比也基本维持不变。

2009年，Onuma等研究了不同保存液对大鼠骨软骨组织在4℃下保存效果的影响。研究比较了DMEM、生理盐水、欧－科林斯（EC）溶液和威斯康星大学（UW）溶液。活细胞数量、损伤程度和组织学评估表明，4℃情况下，UW溶液的表现最佳，而其他溶液都导致了不同程度的软骨细胞形态变化。

添加剂     为了延长新鲜移植物的保质期，研究人员将一些对软骨具有积极作用的物质加入保存溶液中，如抗氧化或抗炎物质、气体（CO2、H2）、胰岛素样生长因子和细胞凋亡抑制剂等，它们已经在研究中被证实能够更好地保护软骨细胞与基质。然而，在关于是否添加血清的问题上，一些研究显示了相反的结果，这可能是由于不同保存溶液配方和血清之间的差异较大所导致的。此外，在保存溶液中加入同种或异种血清，其可能引发的伦理问题、免疫原性和病原体传播的风险也是难以预料的。

其他方法

无论是冷冻、玻璃化还是新鲜保存的方法，都存在其局限性（见表1）。因此，除了对保存方法进行优化，研究者们也在寻找获得供体的新方法。活体供体骨软骨异体移植技术似乎为解决供体短缺提供了另一种思路。这种技术允许在计划的手术条件下（调整关节置换与骨软骨移植手术时间），从供体获取骨软骨移植物，并在几小时内完成移植，避免了传统异体移植中的一些限制，如供体可用性和病毒传播等。2012年的一项报告中，Hangody等介绍了这种无需组织库的骨软骨异体移植技术，并通过影像学和组织学结果，评估了移植软骨的质量。随后在2019年，Hevesi等进行了一项研究，旨在验证活体软骨异体移植作为OCA组织新来源的可行性，并将其与当前用于临床的标准移植物进行了组织学与活性比较。与传统冷藏方法相比，新鲜获取的活体供体软骨在移植时显示出更高的细胞活性和软骨质量，这表明活体供体软骨移植可能是一种提高移植物质量和临床结果的有效方法。此外，CamPbell等研究了氯己定对人类关节软骨细胞活性的影响，并评估了其在骨软骨异体移植中净化受污染移植物的效果。这项研究为污染的移植物提供了一种可能的挽救方案，即使用浓度为0．002％氯己定溶液进行脉冲冲洗。

一种冷冻保存的激光蚀刻骨软骨同种异体移植物（T－LEAllograft）也被报道。研究人员将新鲜获取的软骨组织修整至1mm厚度，并使用特定的激光蚀刻技术在软骨的深面进行蚀刻，以促进细胞的增殖和迁移，随后进行冷冻保存以待取用。这项技术在维持软骨内细胞活性和功能的同时，保留了组织修复和再生所需的生长因子以及软骨基质结构。T－LEAllograft能够在－80℃下储存长达2年，同时保持与新鲜软骨相近的细胞活性水平。这项技术提供了一个随时可用的、高生物活性的软骨修复材料，用以改善软骨缺损的治疗效果。

总结与展望

不同的储存方案对软骨活力和力学性能有显著影响，低温冷冻保存与玻璃化技术虽然能够长时间保存骨软骨移植物，极大地增加移植物可用性，但组织降温和复温的过程，难免对软骨活力和结构产生不利影响。而新鲜保存虽然能够最大限度维持软骨细胞生理状态，使其更适用于移植手术，但保存时间短、可用移植物数量少是它的缺陷。除了对移植物的保存方法进行优化外，许多研究也提供了新的思路，例如，活体捐献骨软骨移植允许临床医生直接从关节置换或截肢手术患者处获取可利用的骨软骨组织；或是对污染移植物进行挽救，增加可用移植物数量等。近年来，骨软骨移植技术在治疗关节软骨缺损方面取得了显著进展，但供体短缺仍然限制着OCA的临床应用。延长OCAs的保存时间，提高移植物的可用性，是解决这一问题的有效办法。通过优化保存方法和开发新技术，有望进一步扩大OCA手术应用并提高软骨修复效果。

来源：实用骨科杂志2024年7月第30卷第7期

(本网站所有内容，凡注明来源为“医脉通”，版权均归医脉通所有，未经授权，任何媒体、网站或个人不得转载，否则将追究法律责任，授权转载时须注明“来源：医脉通”。本网注明来源为其他媒体的内容为转载，转载仅作观点分享，版权归原作者所有，如有侵犯版权，请及时联系我们。)