作者：马振生，南方医科大学口腔医学院；陈婷，南方医科大学南方医院口腔科

先天缺牙是人类常见的发育异常，是指在牙胚形成过程中未能发育和形成牙，属于牙齿发育异常中的数目异常，其中非综合征型先天缺牙是指在牙齿发育过程中不伴有其它全身系统性综合征的先天性牙缺失。临床表现一般累及恒牙列，少累及乳牙列，第三磨牙最常缺失，其他牙缺失数目不等。缺牙存在明显的种族差异，除第三磨牙外，亚洲人中最常见的缺失牙位为下颌切牙，欧美人种最常见的是下颌第二前磨牙和上颌侧切牙缺失。肌节同源盒基因1(msh homeobax 1,MSX1）与非综合征型先天缺牙的发生密切相关。

1.MSX1基因

MSX1位于染色体4p16.3-p16.1上，全长4272 bp，可编码成含297个氨基酸的转录因子，是同源异形盒基因的成员。编码的蛋白质通过与核心转录复合物和其他同源蛋白质的相互作用，在胚胎发生过程中充当转录抑制因子，在颅面发育（尤其是牙生成）中扮演重要角色。

MSX1由2个外显子和1个内含子构成，突变主要集中在MSX1基因的异型同源盒结构区，即2号外显子编码区，该外显子含有一个结合DNA的同源结构域。同源结构域由3个高度保守的螺旋氨基酸链和1个N末端臂组成，在螺旋之间有2个环；外显子1的结构较外显子2简单，突变频率也相应较少。MSX1和配对盒基因9(paired box9,PAX9）编码的转录因子对上皮细胞和间充质细胞起重要作用。

PAX9能在蛋白水平与MSX1相互作用，维持BMP4在间充质中的表达，而BMP4在牙胚由蕾状期向帽状期发育中决定牙齿的形态，PAX9和MSX1突变能导致编码蛋白空间结构改变，影响热稳定性或三维折叠，扰乱编码蛋白的正常功能以及与其他转录因子的相互作用，从而影响牙齿的正常发育。

目前已知有5个转录因子（Lhx6、Lhx8、Lef1、Sp3、Snail）的调节与MSX1的相互作用，与牙齿发育相关的信号通路有很多，其中经典的WNT信号通路主要有：经典的WNT信号通路、细胞极性PCP通路、WNT/Ca2+通路，WNT信号通路参与牙齿生长发育的各个时期。目前认为导致先天缺牙的因素是综合性的。

2.基因突变与基因多态性

1）外显子1

外显子是断裂基因中的编码序列，在剪接后可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质：错义突变（missense mutation）：指可导致多肽产物的氨基酸序列改变或功能性RNA碱基序列改变的碱基替换突变。Chhabra等发现了5个点突变：其中2个导致蛋白质内的替代突变，其余3个形成终止密码子，提前截断蛋白质。M61K和S105x位于同源结构域前方的N'端，Q187x,R196P和S202x都位于外显子2的同源结构域。

他们推测：M61K位于同源结构域外，可导致蛋白质相互作用的中断；R196P突变位于外显子2中。另外，还有未明确指出致病机制的突变点：如袁林天等发现（c.311G>A），导致甘氨酸变为天冬酰胺；（c.458C>T）导致丙氨酸变为缬氨酸。他们的基因突变位点均在外显子1，但缺牙的位置、数目等临床表现却不尽相同，他们推测：疾病由多个基因突变引起、蛋白质的功能可能还受到环境因素、种族、性别和分子调控网络等诸多因素的制约。

张婕在1例新疆维吾尔族家系中发现（c.353C>G）编码的氨基酸由丙氨酸变为甘氨酸，极有可能对牙齿发育造成影响。而Shahid等在一例沙特阿拉伯病例中发现g.5354C>G，甘氨酸取代丙氨酸，发生错义突变，但是他们用SIFT解释为中性突变，即虽突变导致氨基酸改变，但并不引起蛋白质功能改变。

框移突变（frame shift mutation）：是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同。Kim等在外显子1中发现一例62位G碱基复制框移突变，这个额外的G改变了Gly21后的翻译阅读框，146个新的氨基酸取代了其余的蛋白质（p.G22RfsX168），新突变的蛋白质只有167个氨基酸（天然的只有297个氨基酸），而且只有前21个氨基酸与天然蛋白质相同，突变的产物不活跃，不能产生相应的效应。

无义突变（nonsense mutation）：是指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。梁佳发现MSX1无义突变Q189x，该突变导致终止密码的提前出现，可介导在m RNA水平上降解，在表达水平上显著降低，而这些区域对MSX1蛋白的结构稳定性和与DNA结合非常重要；此外Chhabra等发现的5个点突变中：S105x、Q187x、S202x也形成终止密码子，提前截断蛋白质。

干扰起始密码子：Pawlowska等在2位患者中发现5个突变：其中包含外显子1和外显子2。在外显子1中（c.218G>A），位于起始密码子上游18个核苷酸处，靠近起始密码子的位置可能会影响与核糖体相关翻译因子或核糖体本身的结合。

2）外显子2

突变主要集中在MSX1基因的异型同源盒结构区，即2号外显子编码区。错义突变：同源结构域具有结合DNA的作用，若突变发生在此区域，则会直接损害MSX1与DNA的结合：如Yang等发现（c.572t>c），在MSX1中，稳定的二级螺旋结构通过C=O和N-H基团之间的氢键保持。突变导致氨基酸F191S可能导致与188位的谷氨酸的2个额外氢键的生成，突变侧的链变小导致191位丝氨酸和195位的谷氨酰胺的距离增加，可能会迫使邻近残基重新排列位置，从而损害同源域的稳定性并影响与DNA的结合能力。

Mostowska等发现（c.581C>T），突变导致A194V替换，该突变蛋白的功能分析显示，其与DNA和其他转录因子相互作用的能力以及转录抑制能力严重受损；郑静蕾等通过全外显子测序发现（c.670C>T）和（c.809C>T），但后者并未对MSX1表达产生影响，此外，还在外显子1中发现框移突变[c.277delG(p.A93Rfs*67)]、无义突变G122X。

Chishti等揭示了MSX1中第一个隐性突变（由显性基因突变成隐性基因），该突变导致A219T，影响DNA结合和蛋白质-蛋白质相互作用。另外，Reddy等发现的（c.671 T>C）导致亮氨酸被脯氨酸替代；Yamaguchi等在日本的病例中发现的T174I、L205A和Mostowska等发现的1例L224P，同样位于同源结构域，MSX1蛋白中高度保守的残基被取代，影响了DNA结合以及与蛋白质的相互作用。

另外还有不同的致病机制的突变：Mu等在墨西哥的病例中发现（c.476T>G），导致L159R，亮氨酸是疏水氨基酸，而精氨酸是碱性氨基酸，该突变改变了MSX1蛋白和m RNA的二级结构；Zhang等发现的（c.517C>A）导致R173S以及丁婷婷等发现的（c.547C>A）导致Q183K，突变位点高度保守，突变后对蛋白质影响较大。

在一例中国病例中，Xuan等发现（c.662C>A），导致在外显子2的第221位谷氨酸和丙氨酸的替换，位于helix-3上，突变后MSX1和DLX蛋白可能形成异二聚体复合物，通过功能拮抗作用参与上皮-间充质信号级联反应。马腾飞在一例重度非综合征型先天缺牙病例，发现（c.667C>G），导致R223G，推测其是导致疾病发生的原因。

框移突变：MSX1高度保守的C'端，称为MSX同源结构域6(MH6）。Abid等发现（c.572＿573ins GCAAGTT:p.F191fs），该突变位于helix-1末端的第191位，改变了氨基酸序列，并在helix-2的起始位置产生了一个终止密码子，严重影响了与DNA的结合。

Yang等发现（c.590-594 dup TGTCC），突变改变了helix-2的螺旋形状并消除helix-3，从而影响DNA结合、蛋白质与蛋白质的相互作用，他们推测这种新的移码突变对截短的蛋白质的结构有重大影响，导致蛋白质相互作用和DNA结合的受到严重破坏；Alfawaz等在外显子2中发现10个碱基对的移码突变（c.750＿751insACCGGCTGCC,p.F251PfsX92）导致密码子250发生移码，导致引入新的蛋白质序列，并延伸至292密码子；Mitsui等发现（c.844delG,p.A282Rfs*21），产生1个过早的终止密码子。鸟嘌呤缺失发生在MH6结构域上游，产生移码突变，导致不相关的肽链取代了高度保守的MH6序列。

干扰终止密码子：Pawlowska等在2个患者中发现了5个突变：在外显子2中有1个3485C>T纯合子转变，位于终止密码子后6个核苷酸处，他们推测其可能干扰翻译终止，其中涉及m RNA、核糖体、释放因子eRF1和eRF3和相关蛋白之间的相互作用；另外，3755A>G位于3´-UTR，在外显子2终止密码子后275个核苷酸处，可能会干扰针对3´-UTR的转录/翻译因子的结合。

3）内含子

内含子（intron）是断裂基因的非编码序列，可被转录，但在mRNA加工过程中被剪切掉。

Tatematsu等发现在内含子区插入7个核苷酸（c.451＿452insCCCTCAG），形成同源域截断的MSX1(p.R151fsX20）；另外，突变（c.910＿911dupTA,p.304Tyrext48）导致蛋白质编码无法停止，这个突变在MSX1的C´端额外增加了48个氨基酸，使其失去了进入细胞核的能力。

谭灵指出：内含子3´端上游的第2位碱基由A颠换为G，其末端剪切位点AG变为TG，原剪切位点消失，且可能有新剪切位点出现在另一位置；薛晋杰在内含子的5´端，发现（c.469+5 G>A），但是未见MSX1基因的异常剪接，他们推测可能该突变为非致病的或异常剪接的m RNA迅速降解等；Pawlowska等发现在内含子5´剪接位点的18个核苷酸处发生缺失，可能影响参与前体m RNA剪接的组分的结合；Xue等在MSX1基因的内含子中鉴定出杂合的（c.469+5 GNA），该突变显著降低了m RNA水平。

他们推测在牙齿发育的早期，剪接效率的细微差异导致了不同水平的MSX1蛋白，反过来降低了BMP4表达的阈值，扰乱正常牙齿模式。Li等在发现内含子（IVS1-2A>G），使内含子剪接受体位点改变，会引起替代性的前mRNA剪接。

日本学者Tatematsu等提出杂合突变（c.452-9G>A）产生新的剪接受体，导致在c DNA的2个外显子连接处插入7个核苷酸，移码突变发生，并在19个不相关氨基酸序列后产生终止密码子，突变蛋白缺乏同源结构域，影响MSX1的核定位和靶基因的转录调控。

3.CRISPR/Cas9与突变小鼠模型

CRISPR/Cas9是近年发现的一种新型基因组定点编辑技术。Mitsui等报告一个非综合征型先天缺牙病例（框移突变），该病例为常染色体显性遗传，鸟嘌呤缺失位于MH6结构域的上游，导致高度保守的MH6序列被替换。使用CRISPR/Cas9验证基因型-表型相关性，在体外合成了针对MH6上游区域的gRNA，将其与Cas9 mRNA共注射到单细胞合子中。

在镶嵌小鼠中，选择3个突变等位基因进行分析：第21位、28位核苷酸缺失的无义突变、单核苷酸插入导致框移突变；并将选择的小鼠与野生型BDF1小鼠交配。胚胎的冠状切片显示：MSX1(WT/-21）和MSX1(-21/-21）的牙齿和腭发育正常；MSX1(WT/-28）小鼠的腭和牙齿发育正常，但在MSX1(-28/-28）小鼠中可见两种表型：继发性腭裂伴下切牙发育不全、下切牙发育不全及上颚薄。所有患有腭裂的新生鼠纯合子都在新生时期死亡，而那些腭裂较薄的新生鼠是活的。

4周大时的Micro CT显示具有框内纯合突变的小鼠没有牙列异常，除了在纯合的Msx1(-28/-28）小鼠（既有牙齿缺失外，还显示上第三磨牙、下第二磨牙和第三磨牙发育不全以及上第二磨牙过小）。小鼠杂合子MH6破坏不会改变颅面发育，而纯合子破坏导致有或无腭裂的下切牙发育不全以及牙发育不全。先证者家族的突变为常染色体显性遗传，牙齿和腭发育的失败却以常染色体隐性方式遗传。

先天缺牙是颅面部发育异常中常见的一种疾病，其主要的致病因素是基因突变。随着基因检测以及功能分析相关技术的飞速发展，越来越多的致病性基因突变被发现。未来随着研究的进一步进展，有望从基因层面预防和减少先天缺牙的发生。

来源：马振生,陈婷.MSX1导致非综合征型先天缺牙的致病机制研究进展[J].北京口腔医学,2024,32(01):57-60.

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