作者：任枚琪，王联通，温丽琴，全松等，南方医科大学南方医院生殖医学中心

精子DNA损伤是指精子在生成及成熟过程中发生的单链和（或）双链的DNA损伤［1］。其损伤程度通常以精子DNA碎片指数（DNA fragmentation index，DFI）评估，计算方法为：发生DNA损伤的精子占所有计数精子的百分比。多项研究表明，精子DFI对自然妊娠及辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的妊娠结局有着良好的预测价值［2-3］。目前，精子DFI的检测方法主要有：精子染色质扩散（sperm chromatin dispersion，SCD）实验、精子染色质结构分析法（sperm chromatin structure assay，SCSA）、彗星实验（comet assay）、末端转移酶介导的dUTP末端标记法（terminal deoxynucleotidys transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）。其中SCD实验是临床精子DFI检测中最为常用的方法［4］。然而文献报道SCD实验检测的精子DFI与ART后妊娠结局的相关性并不显著［5］，这可能与SCD实验结果的判读方法有关［6-7］。事实上，根据精子DNA扩散程度可将SCD实验结果细化分类为：大晕环、中晕环、小晕环、无晕环和退化精子。其中，小晕环、无晕环和退化精子被视为存在DNA损伤的精子，临床上仅计算三者之和占所有计数精子的比例为精子DFI。然而有研究指出，在SCD实验中不应仅仅关注精子DFI，各晕环类型精子（如大晕环精子百分比）对体外受精（IVF）妊娠结局同样有着良好的预测价值，大晕环精子百分比可能是比精子DFI更好的评判男性生育力的指标［5，8］。然而，不同类型的晕环精子百分比与受精率、优胚率、流产率等IVF/卵胞浆内单精子注射（ICSI）结局指标是否相关仍不清楚。因此，本文回顾性分析184例行SCD实验的男性患者的临床数据，针对不同晕环类型精子的百分比对IVF/ICSI治疗结局的影响进行了细化分析，旨在进一步探讨SCD实验结果的临床应用价值。

1  资料与方法

1.1  研究对象  收集2017年7月至2019年7月就诊于南方医科大学南方医院生殖医学中心行新鲜周期IVF/ICSI治疗以及精子DFI检测的不孕症夫妇。纳入标准：（1）女方年龄为20~45岁，且获卵数≥5个。（2）男方年龄为25~55岁。（3）夫妇双方染色体正常。排除标准：夫妇一方患有甲状腺疾病、心血管疾病、糖尿病等系统性疾病或有毒物及放射性物质接触史。本研究获得南方医科大学南方医院伦理审批委员会批准（伦理审批号：NFEC-2019-026），所有对象均知情同意。

1.2  方法

1.2.1  精液常规分析  依据世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》第5版［9］检测标准进行精液分析。男方禁欲3~7d后手淫取精，将精液置于取精杯内37℃恒温保存，待精液完全液化并充分混匀后采用西班牙SCA公司的计算机辅助精液常规分析（computer-assisted sperm analysis，CASA）系统。精子涂片采用Diff-Quik法染色后，依据Strict标准进行分类，进行精子形态学分析。

1.2.2 精子SCD实验  本研究采用SCD实验检测精子DFI。SCD实验检测原理为：在酸变性和去除核蛋白后，DNA无损伤的精子染色质可扩散形成特征性的晕环，DNA受到损伤的精子则产生很小的晕环或无晕环产生［10］。本研究采用安徽安科生物的SCD试剂盒对精子DNA损伤程度进行检测。每个标本多视野观察至少200条精子，记录不同晕环类型的精子所占百分比。精子DNA损伤程度按Fernández标准［11］分为大、中、小、无晕环精子和退化精子，其依次代表无、轻微、中度、重度DNA损伤的精子以及凋亡精子［12］。具体计算方法参考文献［13］。

1.2.3  IVF/ICSI-胚胎移植（ET）治疗  根据患者个体差异采用不同的促排方案进行控制性超促排卵，通过超声检测卵泡大小及雌二醇（E2）水平监测卵泡发育，卵泡发育成熟后，肌注人绒毛膜促性腺激素（hCG），36h后在阴道超声引导下行穿刺取卵术取卵。男方于取卵当日室温下手淫取精，待精液液化后采用密度梯度离心及上游法处理精子，调整精子浓度后于37℃、5%CO2培养箱中孵育1.5h，待精子获能后进行常规IVF/ICSI受精操作，受精后16~18h观察受精情况，40~42h观察卵裂情况。72h后根据卵裂球形态、发育速度及碎片进行胚胎评分。其中D3观察时，分裂为7~8个细胞且细胞碎片率小于20%者为优质胚胎。选择1~2个优质胚胎进行移植，并予黄体支持［14］，移植后14d尿和血hCG阳性者4周后行超声检查，见宫内妊娠囊为临床妊娠。其中受精率=受精卵子数/获得卵子数，卵裂率=2PN卵裂数/受精卵子数，优胚率=优质胚胎数/2PN卵裂数。

1.3  统计学方法  采用SPSS 24.0软件进行统计分析。根据各类型晕环精子百分比及DFI的第25百分位数（P25）、第75百分位数（P75）的具体数值将各类型晕环精子及DFI各分为3组：≤P25组、P25~P75组、≥P75组。其中计量数据采用均数±标准差表示，计数资料采用率（%）表示。各组间受精率、卵裂率、优胚率的比较采用Kruskal-Wallis H检验，各组间临床妊娠率、流产率的比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  患者基本情况  本研究共纳入184对行IVF/ICSI治疗的不孕症夫妇。其中114例女性患者在IVF/ICSI治疗后接受了新鲜胚胎移植，70例患者因卵巢过度刺激综合征、子宫内膜因素、hCG日高孕酮等原因取消了新鲜胚胎移植，结果见表1。

2.2  各类型晕环精子百分比及DFI各亚组间IVF/ICSI结局的比较  各类型晕环精子百分比及DFI各亚组间IVF/ICSI结局比较结果表2~7。结果显示，大、中、小、无晕环精子和退化精子百分比以及DFI的不同亚组间女性年龄、男性年龄、受精率、卵裂率、临床妊娠率差异无统计学意义（P＞0.05）。但随着小晕环精子百分比的增加，流产率显著增高（χ2=7.471，P=0.024）；随着退化精子百分比的升高，优胚率显著降低（Kruskal-Wallis H检验，P=0.046）。

3  讨论

目前已有大量研究证实，精子DFI是优于常规精液参数的男性生育力评估指标［15-16］。在众多精子DNA碎片检测方法中，SCD实验是应用最为广泛的方法［17］。其主要原因在于：（1）有商业化试剂盒（如Halosperm等）保证实验试剂和流程的标准化。（2）实验操作简单。（3）无需配备昂贵的实验仪器。（4）实验结果可重复性高［18］。由于曾经有学者指出SCD实验计算出的精子DFI与妊娠结局的相关性不显著，因而质疑SCD实验的临床应用价值［5］。事实上，SCD实验检测后在显微镜下可根据精子晕环宽度与细胞核最短直径的比例进一步划分为大、中、小、无晕环及退化精子，晕环越大说明精子DNA完整性越好［11］。然而，在既往的临床实践中关注的仅仅是总的精子DNA碎片率，即小晕环、无晕环以及退化精子的比例之和，这可能会导致细微精子DNA碎片对妊娠结局的影响被低估。2014年Tandara等［8］曾单独对SCD实验中大晕环精子比例与IVF妊娠结局的相关性进行分析，结果提示大晕环精子百分比能够有效预测IVF妊娠结局。然而，其他晕环类型的精子比例与IVF/ICSI后受精率、卵裂率、优胚率及妊娠率等治疗结局的相关性尚不清楚，尚有待深入研究。本研究对不同晕环类型精子百分比与IVF治疗结局进行相关性分析，发现了一系列有着重要临床应用价值的结果。

首先，本研究将夫妇年龄纳入结果分析，各亚组间女性年龄、男性年龄均未见统计学差异，进一步排除了双方年龄对治疗结局的混杂效应。基于上述结果，进一步研究发现，随着退化精子百分比的升高，优胚率显著降低。退化精子代表的是DNA受损严重甚至已经进入凋亡程序的精子。本研究结果提示：精子DNA严重损伤时将显著影响IVF治疗后的胚胎质量。既往有研究表明，卵母细胞功能正常时具有一定的修复精子DNA损伤的能力［19-22］。卵母细胞可通过诱导大量的DNA修复酶和抗凋亡蛋白来克服精子DNA碎片对胚胎发育造成的负面影响，并在胚胎发育的过程中不断修复自身DNA的损伤［23］。但当精子DNA损伤程度过高，超过了卵母细胞修复精子DNA损伤的能力时，胚胎发育则会受到进一步影响［24-25］。本研究对象为卵巢反应正常（获卵数≥5个）的女性及其配偶，排除了卵母细胞质量减退造成的混淆效应。由于退化精子本身即属于DNA损伤程度最高的一类精子，故退化精子比例升高后优胚率下降的原因可能是过高的DNA损伤程度超过了正常卵母细胞的修复能力，引发胚胎DNA损伤、发育潜能下降，从而导致优胚率降低。

 其次，本研究还发现，当女方卵巢反应正常时，随着小晕环精子百分比的升高，流产率显著增高，而大、中晕环以及无晕环、退化精子百分比却与流产率无关。通常认为，大、中晕环的精子代表DNA无损伤的精子，小晕环、无晕环和退化精子代表DNA受到损伤的精子。其中小晕环精子较无晕环和退化精子的DNA损伤程度更小，无晕环精子为DNA重度损伤的精子，退化精子则为染色质受损最为严重甚至已经进入凋亡程序的精子［26］。本研究提示，轻度的精子DNA损伤（小晕环）与流产事件的发生存在相关性。有研究表明，精子细胞核中存在轻度DNA碎片的精子可能在活力和形态方面表现正常，并可使卵母细胞受精［21，27］。由于父源性基因在胚胎发育到4~8个细胞期开始表达［28］，因而受精后胚胎无法正常发育，流产率显著增高。此外，有学者通过SCD实验发现，与无DNA损伤的大晕环、中晕环精子相比，小晕环精子等DNA损伤较严重的精子非整倍性显著增加［29］。而精子的非整倍性将造成胚胎染色体异常，导致IVF早期自然流产率增高［30-31］。本研究结果和既往研究结果提示，小晕环精子具有一定的受精能力，但可能与胚胎发育后续发育阻滞、非整倍体增加有关，并可进一步导致流产率增高。

最后，本研究还发现各晕环精子百分比以及DFI的不同亚组间受精率、卵裂率、临床妊娠率差异均无统计学意义。这可能是由于胚胎发育之初仅与卵子的DNA完整性有关，并由母源基因组调控，而父源性基因在4~8个细胞期才开始表达［28］，故卵母细胞在受精后原核形成和早期卵裂可能不受精子DNA完整性的影响［24］，部分有DNA损伤的精子也可完成受精过程。另一原因可能是由于在进行IVF/ICSI受精前，依据操作流程对精子进行的上游、密度梯度离心等操作已将大部分活力差的精子去除，这样人为的筛选过程减少了射出精子DNA碎片率对IVF治疗结局的影响［32］。而且影响临床妊娠率的因素繁多，除了男方精子因素可能是影响因素之一外，女方子宫内膜容受性［33］、用药种类［34］、对胚胎的选择等均可对其造成影响，因此本文在研究中观察到各晕环精子百分比以及DFI的不同亚组间临床妊娠率差异均无统计学意义。这一研究结果与既往研究结果相似［35］，该研究根据390对不孕夫妇的SCD实验检测结果，将DFI 30%作为临界值，结合线性回归技术发现不同DFI组间的妊娠率差异无统计学意义。

 本研究的优势在于：（1）首次提出并研究SCD实验下的各晕环精子百分比与IVF/ICSI治疗结局的关系，为改善SCD实验结果的解读提供了新思路。（2）本研究纳入的均为女方卵巢反应正常的患者（获卵数≥5个），一定程度上排除了女方卵子因素对IVF/ICSI治疗结局的混杂影响，将各类型精子DNA碎片对IVF/ICSI妊娠结局的影响呈现得更为清晰。本研究的不足在于：由于收录病例数有限，研究结果有待扩大样本量进一步验证，且未能够将IVF和ICSI治疗的患者分开研究，未排除受精方式的混杂影响。

综上所述，本研究首次将不同晕环大小对IVF/ICSI的影响进行细化分析并发现，当女方卵巢反应性正常时，退化精子百分比与优胚率，小晕环精子百分比与流产率之间存在相关性，这提示退化精子百分比可能是预测胚胎质量的更为敏感的指标，高小晕环精子百分比可能增加流产风险［36-38］。本研究为SCD实验结果的解读提供了新的思路，也加深了临床对精子DNA碎片意义的理解。然而本研究纳入的样本量较小，结论尚需更多中心、更大样本的研究进行验证。

参考文献略。

来源：任枚琪，王联通，温丽琴，等.精子染色质扩散实验中精子晕环类型与体外受精/卵胞浆内单精子注射治疗结局相关性研究［J］.中国实用妇科与产科杂志，2024,40(3)：334-339.