作者：付天娇，暴洪博，李晨龙，王宇杰，梁鹏，哈尔滨医科大学附属肿瘤医院神经外科
神经胶质瘤是起源于神经胶质细胞的肿瘤，是中枢神经系统中最常见的原发恶性肿瘤，预后较差，其发病率约占所有中枢神经系统肿瘤的27%，约占恶性肿瘤的80%。神经胶质瘤是最难治疗的肿瘤之一，其中一个原因是血脑屏障限制了放化疗的疗效；另一个原因是神经胶质瘤细胞的高度侵袭性和增殖性，这些细胞很难通过手术完全切除，故而成为临床亟待解决的难题。
N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修饰是真核生物中分布最广、含量最丰富的信使RNA修饰之一，在核复制病毒的RNA中也是如此，而且在癌症发生发展中发挥着不可替代的作用。因此，越来越多的研究关注于mRNA的m6A甲基化修饰。本文主要综述了m6A甲基化修饰在神经胶质瘤中的作用。
1.m6A甲基化
1.1m6A甲基化的概念
m6A甲基化修饰是指RNA的腺嘌呤第六号氮原子上的单甲基化修饰，通常发生在mRNA、lncRNA、circRNA、snRNA、tRNA和rRNA等多种RNA中。研究显示，m6A修饰位点常位于共有序列RRm6ACH(R=G/A，H=A/C/U)上，这些位点主要分布在RNA的3'UTR、终止密码子或者长外显子附近，对RNA前体的剪接、3'末端的处理、出核转运、降解和翻译等过程起着重要调控作用。
m6A是真核生物mRNA和长链非编码RNA上最主要且研究最多的甲基化形式，是动态可逆的过程，甲基由methyltrans-ferase-like3(METTL3)、methyltrans-ferase-like14(METTL14)、wilms'tumor-associatingprotein(WTAP)组成的甲基转移酶复合物转移至腺嘌呤的第六位氮原子，可被脂肪质量与肥胖相关蛋白(fat mass and obesity associated protein，FTO)等去甲基化转移酶修饰。经m6A修饰后的RNA可被YTH结构域家族蛋白特异性识别，进一步调控mRNA的可变剪接、出核转运、翻译和降解。
1.2m6A甲基化蛋白及其生物功能
参与m6A甲基化的蛋白主要有甲基转移酶(METTL3/14/16、WTAP、KIAA1429、RBM15/15B、ZC3H13等)、去甲基酶(ALKBH5、FTO)和RNA结合蛋白(YTHDC1-2、YTHDF1/2/3、eIF3、HNRNPA2B1、HNRNPC、Prrc2a等)三类。
1.2.1m6A甲基转移酶
甲基转移酶即m6A编码器(writers)。RNA甲基转移酶由METTL3和METTL14形成异二聚体催化核心并和一个调节亚基WTAP组成。实验表明，METTL3和METTL14形成化学计量比为1∶1的稳定但不对称的METTL3-14复合物，WTAP与METTL3-14复合物相互作用影响体内m6A甲基转移酶的活性和核斑点的定位。
其中METTL3是具有催化活性的亚基，需要结合供体底物S-腺苷-蛋氨酸(SAM)在催化部位；而METTL14是一种失活的甲基转移酶，它是METTL3酶活性的变构激活剂，促进METTL3识别RNA底物。
最近研究显示，m6A修饰在Lys36(H3K36me3)峰的组蛋白H3甲基化附近富集，当细胞内H3K36me3耗尽时，m6A修饰减少。H3K36me3直接被METTL14识别和结合，介导m6A在新合成的RNA上沉积。WTAP将METTL3和METTL14锚定在核斑点中，并赋予m6A沉积在转录本和其中选定位点组中的特异性。而KIAA1429是新发现的甲基转移酶组成成分，其N端能够聚集甲基转移酶催化核心METTL3/METTL14/WTAP，进而定点调节m6A水平。
最近研究显示，METTL16被鉴定为另一种具有催化活性的m6AmRNA甲基转移酶，在mRNA的稳定性和剪接中起着重要作用。METTL16依靠RNA序列和结构的组合来识别其RNA底物或直接与mRNA前体结合参与大部分甲基化反应。此外，有研究表明同时或单独敲低RBM15和RBM15B可导致mRNA中m6A水平的显着降低。
1.2.2m6A去甲基化酶
m6A去甲基化酶即m6A消码器(erasers)，确保转录组中m6A修饰的动态平衡。目前仅发现两种m6A去甲基化酶，FTO和ALKB同源蛋白5(ALKBhomolog5，ALKBH5)，两者虽然都属于ALKB家族，但对m6A修饰的擦除作用是互不影响的。
研究表明，ALKBH5与核斑点共定位，调节mRNA加工因子的组装/修饰，并调节mRNA输出和稳定性。然而，最近的多份报告暗示m6A可能不是FTO的生理相关靶点。例如，在FTO基因敲除小鼠的胚胎和细胞中，m6A水平没有增加。
在神经胶质瘤中，只有0.1%的ALKBH5基因发生突变，FTO中没有突变的报道。然而，就像乳腺癌一样，ALKBH5的高表达可能是通过诱导缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)发生的，与胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)患者预后差相关。
1.2.3m6A识别蛋白
m6A识别蛋白即m6A读码器(readers)，能够选择性识别靶RNA的m6A甲基化修饰，通过与m6A修饰区域特异性结合或者改变RNA二级结构使蛋白利于与RNA结合等方式行使功能，进而参与RNA代谢的各个阶段。包括YTH结构域家族中定位于细胞质的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC2和定位于细胞核的YTHDC1，核不均一核糖蛋白家族HNRNPC和HNRNPA2B1，以及真核起始因子eIF3、Prrc2a等。
YTH结构域蛋白家族是最早发现的阅读器蛋白家族之一。通过调节RNA的剪接、翻译和定位，广泛参与转录后调节。在识别m6A甲基化位点后，YTHDF2募集CCR4-NOT腺苷酸酶复合体或HRSP12/RNaseP/MRP复合物，加速RNA的脱腺苷酸化和切割，使目标mRNA不稳定并进一步衰减。其中，YTHDF3可与YTHDF1协同作用促进m6A修饰的mRNA翻译，YTHDF3与YTHDF2的协同作用可能导致m6A修饰的靶RNA发生降解。
HNRNPA2B1与m6A修饰的碱基不能直接结合，它与作为miRNA初级体(pri-miRNA)微处理器复合物组分的DGCR8蛋白相互作用，促进pri-miRNA的加工。eIF3蛋白能够与mRNA5′UTR端的m6A修饰位点结合促进mRNA翻译，这是一种不依赖于帽子结合因子的eIF3激活翻译起始的新机制。
Prrc2a是一种新的m6A阅读器，它通过依赖m6A的方式与CDS区域中的共有GGACU基序结合进而稳定mRNA的表达。此外，核糖体也可以作为m6A读码器。但其对m6AmRNA稳定性和/或翻译的影响程度尚不清楚。
2.m6A甲基化与癌症
越来越多的证据表明，m6A基因修饰与人类多种肿瘤的发生密切相关。m6A修饰酶表达量的改变，可以通过改变肿瘤相关基因mRNA的甲基化水平，进而影响下游致癌基因或抑癌基因的表达，从而开辟肿瘤治疗的新途径。最近对10000例含33例以上癌症类型的患者进行的一项关于m6A编码器、消码器和读码器的分子改变和临床相关性的系统分析表明，这些调节因子与癌症通路的激活和抑制密切相关，并且与具有预后意义的肿瘤亚型相关。
这些改变通过调节不同下游靶点的mRNA稳定性或蛋白质翻译，在不同的癌症功能中发挥作用，包括癌症干细胞形成、上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、癌症代谢、细胞凋亡和信号转导。例如：METTL3可促进致癌mRNA的翻译，也可损害癌细胞的EMT。
METTL3、METTL14和FTO均可能通过增强MYC、MYB、Bcl-2和PTEN的表达进而促进细胞增殖并抑制分化，调控造血干细胞的髓样分化。目前认为分化诱导剂靶向结合METTL14是新的有效治疗急性髓系白血病(acute myeloid leukaemia，AML)的方案。此外，在胃癌中，m6A修饰的减少可能通过激活致癌信号促进胃癌的恶性进展，而FTO作为癌基因可以促进肿瘤的生长。
YTHDF1与结直肠癌的致瘤性和肿瘤干细胞样活性有关。另有研究指出，首次发现METTL3/YTHDF1的异常表达与肝癌的总体生存率相关，METTL3/YTHDF1低表达组预后较好。
3.m6A修饰在神经胶质瘤中的作用
3.1m6A修饰与神经胶质瘤的诊断
表观遗传学改变是诊断GBM的前景标志物。另外，一些表观遗传状态确实可以解释GBM的结果。例如，O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)的表观遗传沉默显著影响了替莫唑胺(Trimetazidine，TMZ)对GBM患者的治疗效果。因此，MGMT启动子的甲基化状态是预测GBM患者生存期和其对TMZ反应的重要生物学标志。
研究表明，无论是抑制METTL3还是过度表达FTO，都会降低m6A表达，进而减少凋亡细胞的数量，导致神经胶质瘤U251细胞系的转移和增殖能力显著增强，反之亦然。RNA免疫印迹结果显示，神经胶质瘤组织中m6A的表达水平明显低于正常组织。
胶质母细胞瘤干细胞(glioblastoma stem cells，GBMSCs)具有特别强的放射抗性和侵袭性，是GBM复发率高的原因之一。有研究表明，ALKBH5通过促进GBMSCs的侵袭能力进而提高GBM的侵袭性；而METTL3/METTL4过表达会抑制GBMSCs的生长和自我更新。
m6A修饰的规律性变化可以预测GBM患者的预后或用于GBM的诊断。相关研究表明，外周血RNA中的m6A是胃癌的生物标志物。miRNAs的甲基化水平是早期胃肠癌的潜在诊断生物标志物。m6A消码器ALKBH5和FTO是肾透明细胞癌患者的预后生物标志物。而YTHDF1的表达水平与神经胶质瘤恶性程度呈正相关，那么对于中枢神经系统肿瘤，从外周血或脑脊液中鉴定相关的m6A修饰可能是诊断GBM的一种有前途的方法。
3.2m6A修饰的表达与神经胶质瘤临床病理特征的关系
考虑到m6A修饰相关蛋白在肿瘤发生发展中的重要生物学功能，一些研究人员基于对基因组图谱的数据和生物信息学的分析，系统地研究了每种类型的m6A调节酶与神经胶质瘤病理特征的关系，包括WHO分类、异柠檬酸脱氢酶明，大多数m6A调节酶的表达水平与WHO组织学分级及相应的分类密切相关。定量分析显示，WTAP、YTHDF、ALKBH5、FTO的表达水平与组织学分级呈显著相关，其中WTAP、YTHDF、ALKBH5的表达丰度与组织学分级呈正相关，而FTO的表达丰度与组织学分级呈负相关。
3.3m6A修饰在神经胶质瘤中的潜在治疗意义
DNA、组蛋白和其他蛋白质的共价修饰在癌症治疗方面显示出一定的潜力。美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)已经批准了一些表观遗传药物，如亚苯胺异羟肟酸(suberanilohydroxamic acid，SAHA)、罗米迪辛(Romidessin)、贝利诺斯特(Belinostat)和潘诺比坦(Panobinostat)。中国国家医疗产品管理局也批准西达本胺(Chidamide)用于治疗某些T细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
此外，许多其他表观遗传药物的临床试验也正在进行中。针对蛋白翻译后修饰物(如E3泛素蛋白连接酶)的药物，包括S期激酶相关蛋白2(SKP2)、斑点型BTB/POZ蛋白(SPOP)、细胞凋亡抑制因子2(cIAP)和后期促进复合物/环体(APC/C)，也已在临床实践和临床前应用中进行了评估。
m6A是RNA在转录后水平最常见的共价修饰。科学家们正在探索其在恶性肿瘤(如GBM)中的治疗潜力。目前，一些制药公司正计划开发METTL3-METTL14复合物和ADAR的小分子抑制剂。几种含哌啶环或哌嗪环的化合物与METTL3-METTL14-WTAP复合物有很高的协同结合效率，从而激活RNA甲基化。
最近，METTL3小分子抑制剂也显示出抑制体内AML进展的能力。在上述最新研究的基础上，相信未来与m6A修饰相关的神经胶质瘤靶向(isocitrate dehydrogenase，IDH)分类和1p/19q状态。结果表治疗将很快被开发出来。
此外，m6A在泛癌队列中的应用揭示了其与不同肿瘤的预后和PD-L1表达的相关性，例如有研究表明，在胃癌患者中，与m6A评分高的患者相比，m6A评分低的患者接受抗PD-1/L1免疫治疗具有显著的治疗优势和临床反应；在肺腺癌患者抗PD-L1治疗研究中，发现m6A评分高的患者的疗效明显优于m6A评分低的患者，且完全/部分缓解患者的评分也较高。因此，m6A调节因子的表达模式对预测抗癌免疫应答具有重要意义，可作为预测PD-L1等免疫治疗对GBM患者疗效的有力工具。
3.4m6A修饰与神经胶质瘤患者预后的关系
研究人员对中国神经胶质瘤基因组图谱(the Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA)数据库中m6A相关蛋白的表达水平进行了单因素Cox回归分析，发现高危基因主要包括ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、HNRNPC和WTAP，保护基因主要为FTO、YTHDC1和METTL3。在成人低级别神经胶质瘤(low-grade gliomas，LGGs)中，YTHDF2、WTAP、ALKBH5、HNRNPC、YTHDF1和FTO的表达水平与IDH突变型神经胶质瘤患者的总生存期(OS)显著相关。
综上所述，YTHDF2、HNRNPC和YTHDF1对IDH野生型的LGGs有预测价值，FTO、YTHDF2和RBM15对IDH野生型的GBM有预测价值，FTO对IDH突变的GBM也有预测价值。此外，m6A调节酶得出的风险评分可以独立预测神经胶质瘤患者的预后。对于WHO分级为II级和III级的神经胶质瘤，高风险评分的患者的OS明显短于低风险评分的患者。根据CGGA和癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库，风险分数高的GBM患者对TMZ治疗也更敏感，抗药性相对较低。
4.总结与展望
综上所述，目前在神经胶质瘤中主要有METTL3、ALKBH5、WTAP、FTO和YTH结构域蛋白等表达异常，通过影响m6A甲基化水平，改变mRNA稳定性，调控肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭能力。m6A在神经胶质瘤中的表达不同，这表明m6A修饰在神经胶质瘤的发生发展过程中不仅可能起到促进作用，而且可能对肿瘤的发生发展起到抑制作用。因此，通过调节m6A相关基因可能为神经胶质瘤的早期诊断和靶向治疗提供新思路。
来源：付天娇,暴洪博,李晨龙等.m6A修饰在神经胶质瘤中的研究进展[J].现代肿瘤医学,2023,31(17):3296-3300.
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