作者：张敏敏 陈 蓉 王庆忠 徐 蓉等，上海市临床检验中心
沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）是一种细胞内寄生的微小微生物，分为小鼠生物型、沙眼生物型和性病淋巴肉芽肿生物型，后2种与人类疾病有关，是常见的性传播疾病病原体，可引起男性尿道炎、附睾炎和女性
由于现有的商品化沙眼衣原体质控品多为沙眼衣原体蛋白粗提物，稳定性差，保存期短，导致沙眼衣原体在培养和鉴定时经常发生漏检、错检的情况。为提高临床实验室沙眼衣原体检测质量，本研究选取HELA-299细胞株培养沙眼衣原体血清型E，并制备成可模拟临床样本的沙眼衣原体检测质控品，适用于胶体金法和乳胶法沙眼衣原体检测的质量控制，并将其用于上海市临床检验中心EQA计划，以评估上海地区临床实验室沙眼衣原体检测结果的一致性，促进该项目检测质量的提高。
1 材料和方法
1.1 细胞株和菌株
选取HELA-299细胞株（武汉普诺赛生命科技有限公司）培养沙眼衣原体。沙眼衣原体血清型E购自美国典型菌种保藏库。
1.2 主要仪器和试剂
RPMI-1640培养基（GIBCO）、胎牛血清（GIBCO）、沙眼衣原体
1.3 方法
1.3.1 质控品的制备
1）将HELA-299细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃ 5%CO2培养箱内培养2周，每周传代3次，挑选生长状态良好的细胞待用。2）挑选6孔板中生长状态良好的单层细胞，弃去培养液，加入含2 g/mL放线菌酮的细胞培养液，接种沙眼衣原体血清型E，285×g，35 ℃离心60 min，于37 ℃、5%CO2培养箱内培养72 h。在倒置显微镜下观察生长的沙眼衣原体包涵体，用细胞刷刮下感染细胞，超声波破碎，285×g离心10 min去除细胞碎片，再离心10 min沉淀沙眼衣原体，悬浮于0.2 mol/L
HELA-299细胞生长于含直径24 mm盖玻片的6孔细胞培养板内，弃去培养液，加入含 2 g/mL放线菌酮的细胞培养液，接种沙眼衣原体血清型E，428×g、35 ℃离心60 min，于37 ℃ 5%CO2培养箱培养48 h。弃去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，甲醇固定盖玻片10 min。将抗沙眼衣原体单克隆抗体直接荧光法染色，于荧光显微镜下计数包涵体数量，确定沙眼衣原体血清型E浓度为3.50×l09 IFU/mL。采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）-荧光探针法确认。
1.3.2 均匀性和稳定性验证
取20支制备的沙眼衣原体质控品，按照CNASGL003《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[4] 要求进行均匀性和稳定性验证。
1.3.3 EQA计划
上海市临床检验中心沙眼衣原体项目EQA质控品每份5支，0.3 mL/支，其中2支为细胞培养液（阴性样本），3支为制备的沙眼衣原体质控品稀释液（低浓度2支，高浓度1支）。将5支样本随机编号，-20 ℃保存待用。将质控品经冷链运输发送给参评实验室，要求其使用实验室常规检测方法和试剂进行检测，并在规定时间内上报检测结果。上海市临床检验中心依据参评实验室回报结果与预期结果的符合情况进行评分：每鉴定正确1支计20分，≥80分为合格。对实验室成绩进行汇总，并对错误的检测结果进行分析。1.4 统计学方法
采用Excel 2007软件进行数据分析。计数资料以例或率表示。
2 结果
2.1 沙眼衣原体PCR-荧光探针法检测结果
沙眼衣原体PCR-荧光探针法检测结果显示培养物为沙眼衣原体。见图1。
2.2 沙眼衣原体质控品均匀性和稳定性验证结果
制备的沙眼衣原体质控品用于胶体金法和乳胶法沙眼衣原体抗原检测试剂盒，检测结果显示均与预期相符。见图2。
2.3 参评实验室EQA成绩
有54家临床实验室参加上海市临床检验中心沙眼衣原体项目EQA计划，其中51家实验室回报结果，仅有23家实验室回报结果中有强阳、弱阳之分。51家临床实验室中，有22家使用胶体金法、29家使用乳胶法进行检测。所有汇报结果的实验室结果均符合预期，EQA成绩均为100分。
3 讨论
生殖道沙眼衣原体感染已成为越来越被关注的公共卫生问题，女性的沙眼衣原体感染率高于男性，尤其是拉丁美洲、非洲地区的女 性[5] 。有研究结果显示，2012年以来，生殖道沙眼衣原体感染发病率呈上升趋势，且女性年均发病率高于男性[6-7] 。2015—2019年中国生殖道沙眼衣原体感染报告显示，沙眼衣原体感染呈增长趋势，且感染率较高，我国高发地区为东南沿海，受累人群广泛，且有年轻化倾向[6] 。
目前，临床实验室常用的沙眼衣原体检测方法主要有细胞培养法、抗原检测、PCR荧光探针法。有学者开发了一种可在30 min内同时检测沙眼衣原体和奈瑟菌的快速多重PCR方法，并验证了其临床适用性[9] 。实时荧光PCR对生殖道沙眼衣原体感染，尤其是对隐性和弱阳性感染的检测性能也得到了验证[10] 。在感染率高的国家和地区，沙眼衣原体筛查越来越受到重视[11] 。
泌尿生殖道感染患者多数无临床症状或症状较轻，及时检测，准确诊断，并进行有针对性的治疗能够在一定程度上减少其引发的生殖道严重并发症[12] 。有研究发现，无症状沙眼衣原体感染在年轻女性中显著流行，在资源有限的国家，需要对有风险的无症状感染者，特别是年轻成年女性，进行有针对性的筛查，亟需成本低、快速、准确的检测方法[13] 。
EQA可有效监测临床实验室的检测能力，发现检测过程中存在的问题，从而减少沙眼衣原体的漏检、错检。本研究制备了沙眼衣原体质控品，并对上海地区临床实验室该项目检测能力进行了评价，结果显示，上海地区临床实验室沙眼衣原体检测准确性和重复性整体较好。本研究发放的EQA质控品中，将阳性样本设置了高、低2个浓度梯度，51份上报结果中，仅有23份有强阳、弱阳之分，且因参评实验室较少、检测方法和试剂的使用较为单一，本研究未能对不同检测方法和商品化试剂检测结果的一致性进行评价，但随着自制质控品越来越多地应用于EQA项目，我们将重点考评该问题，并通过浓度梯度将沙眼衣原体EQA质控品进行定量，以便客观地评价实验室的检测能力，促进上海地区沙眼衣原体检测的标准化，提高微生物检验EQA的质量和评价标准，使临床实验室检验质量控制管理工作更加科学、公平、公正。
参考文献略。
来源：张敏敏,陈蓉,王庆忠,徐蓉,刘学杰,崔琳,罗云桃,夏启航,钱诚凯,王敬华.沙眼衣原体室间质量控制质控品的制备及其应用[J].检验医学,2023,38(01):78-80.
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