作者：南京医科大学第一附属医院脊柱外科 赵书杰
脊髓损伤（SCI）根据受伤原因可分为创伤性和非创伤性伤两大类。创伤性脊髓损伤（tSCI）主要由暴力，如车祸、高处坠落等造成的SCI，也存在无骨折脱位SCI的情况。非创伤性脊髓损伤主要指的是由肿瘤、感染或椎间盘退行性疾病等急慢性过程造成的损伤。由于病因学较大的异质性，目前的研究主要集中在tSCI。全球tSCI的发生率约为13/100000，每年新增患者约9.3万例，致残率约为130/100000。每年需花费数以百亿美元用于患者的治疗和康复。中国tSCI的死亡率逐年提高，从2006年的0.19/100000上升至2016年的0.31/100000。tSCI按其病理过程分为原发性损伤和继发性损伤。脊髓微环境是脊髓组织细胞的正常代谢和功能活动的环境，主要由神经细胞、胶质细胞、免疫细胞、各种细胞因子以及局部的血供、氧浓度、pH值、离子浓度等构成，是一个复杂的综合体。我们将该微环境分为由各种免疫细胞、炎症因子、趋化因子等组成的免疫微环境和非免疫细胞、血供、氧浓度、离子平衡、酸碱平衡等构成的非免疫微环境两大类。笔者结合我们团队在继发性SCI方面所做的研究工作，系统地回顾tSCI后微环境的变化，并对免疫和非免疫微环境的变化的区别和联系进行综述，报道如下
免疫微环境失衡
与骨骼、皮肤等组织损伤后的修复不同，SCI后免疫炎症反应并不会逐渐减弱和消失，而是持续存在。异常持续激活的免疫微环境也正是SCI后难以愈合的主要原因之一。参与脊髓微环境失衡的主要是中性粒细胞、小胶质细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞及多种炎症及趋化因子。
中性粒细胞 SCI后24h，损伤部位浸润的中性粒细胞数量达到峰值。目前关于中性粒细胞在继发性SCI中的作用仍存在争议。Kang等将小鼠髓系细胞的IκBkinaseIKK-β基因敲除并损伤小鼠脊髓后，发现小鼠的中性粒细胞的浸润显著减少、运动功能受损减轻；此外，该研究团队还发现中性粒细胞中IKK-β基因的缺失可导致核因子κB（NF-κB）失活，白细胞介素6（IL6）、白细胞介素1β（IL1β）和
小胶质细胞和巨噬细胞 作为主要的固有免疫细胞，小胶质细胞和外周来源的巨噬细胞在SCI后的作用近年来备受关注。作为分布在脊髓的免疫细胞，在SCI后即刻，小胶质细胞便被激活，分泌细胞因子及趋化因子招募中性粒细胞、巨噬细胞。而巨噬细胞约在SCI后48~72h浸润至损伤区域，在7~10d达到峰值，并长期存在。从分布区域来看，巨噬细胞主要集中分布于损伤区域中心；而小胶质细胞分布于损伤区域周边，相比于巨噬细胞，小胶质细胞有着很强的增殖能力。Landete等研究显示，在小鼠SCI模型中，特异性去除小胶质细胞会导致胶质瘢痕形成障碍、增加免疫细胞浸润、抑制神经元与少突胶质细胞存活并抑制运动功能恢复；而使用巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）促进小胶质细胞增殖可以减少损伤区域的面积，促进脊髓功能恢复。此外，SCI后，小胶质细胞分泌的
Kong等研究表明，与小胶质细胞相比，巨噬细胞有着较强的吞噬能力，SCI后早期损伤部位存在的大量髓鞘碎片主要由巨噬细胞所清除；而将小鼠敲除巨噬细胞清道夫受体1（MSR1）基因后进行SCI造模，脊髓组织损伤范围变小，运动功能恢复较好。巨噬细胞MSR1可介导吞噬大量髓鞘碎片，由于髓鞘碎片富含脂质，导致自身形成促炎型“泡沫样”巨噬细胞，通过NF-κB信号通路，上调炎症因子IL1β和TNFα的分泌，导致神经元凋亡，加重SCI。小胶质细胞和巨噬细胞都有较强可塑性，可向M1-like（促炎型）和M2-like（抗炎型）分化，既往研究显示，SCI后7d内，巨噬细胞和小胶质细胞中混杂着M1-like型和M2-like型，但随着时间推移，M2-like型所占比例逐渐减少至消失，而M1-like型逐渐增多，并长期占主导。M1-like型巨噬细胞或小胶质细胞可产生大量的促炎因子和活性氧（ROS）从而加重细胞和组织损伤；另外还可作为抗原提呈细胞，激活T细胞，调节适应性免疫，在体外共培养实验中，M1-like型巨噬细胞可分泌硫酸
T细胞和B细胞 既往认为，在小鼠和大鼠SCI后约1周，T细胞和B细胞可浸润至损伤部位，并发挥长期效应。而Sun等发现γδT细胞于SCI后24h即可浸润至损伤部位，主要为Vγ4亚型，并分泌IFNγ导致巨噬细胞向M1-like型极化，分泌多种促炎因子，加重SCI；而使用Vγ4抗体可抑制γδT细胞分泌INFγ，减轻SCI。此外，和对照组小鼠相比，缺失γδT细胞小鼠SCI后有着更好的功能恢复。在SCI患者的血清中存在较高浓度的中枢神经系统反应性IgG和IgM，这表明SCI可激活中枢神经系统反应性T细胞和B细胞。既往研究表明，自身反应性T细胞可对神经元和胶质细胞产生直接毒性作用。此外，自身反应性T细胞还可通过分泌炎症因子（如IL1β、TNFα、IL12）及趋化因子[如CC趋化因子配体2（CCL2）、CC趋化因子配体5（CCL5）和趋化因子C-X-C基序配体10（CXCL10）等]或激活小胶质细胞，间接参与SCI后免疫微环境紊乱。Potas等对裸鼠（无T细胞）进行SCI造模后发现，T细胞的缺失可起到保护脊髓组织、促进运动功能的恢复。在生理条件下，CD4+Foxp3+调节性T细胞（Treg）可通过多种途径抑制CD4+辅助T细胞（Teff），避免其过度活化。而在SCI后，这一抑制效应被解除。自身反应性Teff细胞的活化可通过分泌促炎因子、诱导巨噬细胞向M1-like型极化以及促进FAS介导的神经元和少突胶质细胞凋亡等加重SCI。此外，Teff细胞还可促进抗原特异性B细胞、分化为可产生自身抗体的
细胞因子 tSCI后，各类细胞因子可发生时间及空间上表达及分布的异常。既往研究显示，SCI后15min即可检测到促炎细胞因子IL1β的表达，其表达水平在24h内持续升高并达到峰值，随后开始下降；TNFα的mRNA水平在SCI后1h迅速达到高峰，2h后略有下降，但仍可在伤后24h保持较高的水平，直至72h恢复至基线水平；而IL6的mRNA水平上升较为缓慢，在SCI后6~12h达到高峰，至24h左右开始下降。异常高浓度的促炎细胞因子可通过激活微环境内各类靶细胞的NF-κB、AP1和ATF等转录因子，上调COX-2、iNOS和各类蛋白酶的表达，加重组织损伤。值得注意的是，有文献报道，低浓度的促炎细胞因子IL1β和IL6可促进神经营养素的表达，并可诱导细胞表面的粘附分子表达，如细胞间粘附分子-1、P-选择素和E-选择素，招募免疫细胞至损伤部位。此外，Cafferty等研究报道，IL6参与调节轴突再生和胶质增生；SCI后，IL6的缺失会对运动功能的恢复不利。上述研究提示，SCI后，调控促炎因子在一定的范围内可对组织修复起到促进作用。而微环境内的趋化因子主要发挥募集各类细胞的作用。
Garcia等的研究表明，SCI后1h可检测到CCL2在mRNA水平上的升高，并于24h达峰值，到14天时恢复至较低水平。而CXCL10的表达水平在伤后1h即可升高，6h可达峰值，直至伤后5d仍保持较高水平，于第14d恢复到基线水平。此外，微环境内存在的硫酸软骨素蛋白多糖（CSPGs）、髓鞘相关糖蛋白、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白和轴突生长抑制因子-A等通过受体作用于Ras同源基因-Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶（Rho-ROCK）通路，抑制轴突生长，从而阻止神经功能恢复。值得注意的是，Zhao等研究发现，SCI后，各类细胞因子、趋化因子及神经相关分子不仅在伤后不同时间点存在变化，在同一时间点损伤不同部位（损伤中心、损伤头端及损伤尾端）也存在差异。这也进一步提示了SCI后微环境中上述各类分子变化的复杂性。然而，既往的研究多是基于传统的转录组或蛋白组测序，在SCI后不同时间点使用新近开发的空间单细胞转录组测序技术可以更准确地阐明不同分子的细胞来源以及时间和空间的变化特点。
非免疫微环境失衡
继发性SCI非免疫微环境的失衡主要包括脊髓组织缺血缺氧、
缺血缺氧 继发性SCI早期由于血管损伤、痉挛以及组织
谷氨酸蓄积与离子失衡 SCI后，直接的物理损伤及缺血缺氧微环境可诱导神经元细胞外谷氨酸蓄积。Fan等研究表明，在SCI早期，谷氨酸在脑脊液中的浓度随时间延长逐渐升高，并且脑脊液中兴奋性
缺血再灌注损伤 与缺血缺氧产生的病理生理机制类似，脊髓组织受到再灌注损伤（IRI）后可导致细胞能量代谢障碍，胞内线粒体电子传递链脱耦联，产生和释放大量氧自由基和ROS。组织内累积的强氧化物引起神经细胞和胶质细胞的细胞膜、髓鞘等发生脂质过氧化，加重组织损伤。Fan等研究表明，氧化应激是继发性SCI的主要病理机制，迅速平衡脊髓内的氧化应激状态是治疗继发性SCI，保护脊髓神经细胞功能的重要途径。同时，Fan等发现脊髓缺血再灌注可显著上调c-Jun氨基末端激酶（JNK）（Thr83/Tyr85）的磷酸化水平，一方面使Bcl-2相关死亡促进蛋白（BAD）（Ser136）去磷酸化并与14-3-3发生解离，导致BAD与Bcl-2或Bcl-XL结合，引起线粒体释放细胞色素c，导致神经元凋亡；另一方面使Bcl-2的ser70磷酸化，使Beclin1/Bcl-2发生解离，导致神经元自噬性死亡。Chen等通过体内外实验发现脊髓缺血再灌注时，G蛋白耦联受体激酶结合蛋白-1（GIT1）具有减轻脊髓组织损伤，拮抗神经元凋亡的作用。GIT1可通过盘绕结构（CC）与ASK1的盘绕结构相互结合，抑制ASK1的自身二聚体化，进而抑制ASK1介导的JNK-p38信号通路的激活。Huang等研究表明，GIT1基因敲除小鼠神经元中线粒体-自噬溶酶体数量及线粒体自噬后相关蛋白及标志物在缺血再灌注后明显减少，从而从机制上证明了GIT1通过调控Beclin-1（Thr119）磷酸化，促进Parkin向线粒体外膜移位，这一过程不受PTEN诱导激酶1（PINK1）的影响。但是PINK1基因敲除后，过表达的GIT1却无法发挥诱导Parkin向线粒体外膜转位的作用。此外，GIT1也通过作用于自噬相关蛋白LC3，增加自噬流以促进线粒体自噬。通过腺相关病毒在小鼠神经元细胞中特异性过表达GIT1蛋白，可增加线粒体自噬，减少神经元凋亡，促进SCI后功能恢复。此外，与单纯缺血缺氧不同，再灌注时还可带来大量免疫细胞（主要是中性粒细胞）与炎症因子，协同免疫微环境的失衡，进一步加重脊髓组织的损伤。
星形胶质细胞 作为中枢神经系统胶质成分的主要细胞，星形胶质细胞可在生理条件下维持血脑屏障的结构和功能、为神经元提供营养和生长因子、并可去除细胞外异常增高的谷氨酸。Herrmann等发现，星形胶质细胞信号传导与转录激活因子3（STAT3）的基因敲除小鼠在SCI后，胶质瘢痕形成障碍，且加速小鼠体内炎症播散、扩大损伤范围并减缓运动功能恢复等。但胶质瘢痕长期存在又可阻碍轴突长入和神经再生。星形胶质细胞虽不是免疫细胞，但在调节SCI后免疫微环境中发挥重要作用。Pineau等研究发现，SCI后早期，星形胶质细胞通过分化增加反应蛋白88（MyD88）和1型白细胞介素1受体（type1，IL-1R1）的表达以及一系列趋化因子，如CCL2、趋化因子C-X-C基序配体1（CXCL1）和趋化因子C-X-C基序配体2（CXCL2）的分泌，招募中心粒细胞和促炎型巨噬细胞至损伤部位。此外，星形胶质细胞还可分泌TNFα、白细胞介素12（IL12）、干扰素γ（IFNγ）、TGF-β及白细胞介素10（IL10）等细胞因子来调控小胶质细胞/巨噬细胞向M1-like型或M2-lik型转化。近年来，星形胶质细胞在中枢神经系统损伤后表现出的细胞形态和功能的多样性备受关注。因此，有研究者将星形胶质细胞划分为具有促炎作用的A1型和具有神经营养和组织修复功能的A2型。
Qian等研究显示，SCI后早期，A1型星形胶质细胞数量较少，伤后28d，损伤部位形成明显的胶质瘢痕，A1型星形胶质细胞数量明显升高，并且A1型星形胶质内Notch信号及其下游基因表达也显著上调。体外研究表明，Notch的细胞内结构域（NICD）能够与STAT3结合，促进STAT3的磷酸化和入核，导致星形胶质细胞向A1型分化。Notch通路的抑制剂能抑制A1型星形胶质细胞的形成，并抑制其分泌Notch通路依赖的炎症因子，从而减轻神经元凋亡和轴突损伤。因此，特异性抑制星形胶质细胞的Notch通路可能是治疗SCI具有临床运用前景的可行性方法。
非免疫微环境失衡与免疫微环境失衡之间的相互影响
非免疫微环境失衡造成的细胞死亡可促进免疫细胞的浸润、增强免疫炎症反应；而免疫微环境的失衡后造成的组织损伤也可引起非免疫微环境的失衡。因此，两者构成“恶性循环”，加重脊髓组织的损伤。非免疫微环境失衡造成细胞的损伤可释放各类受损相关分子模式（DAMPs）与小胶质细胞或巨噬细胞表面相应模式识别受体结合，激活并导致大量趋化因子、细胞因子和基质金属蛋白酶等产生和分泌，进一步招募更多的小胶质细胞或巨噬细胞并加重组织损伤。此外，因缺血缺氧或再灌注损伤造成的凋亡神经元或胶质细胞等可通过产生“找我（findme）”信号，如CX3CL1、核苷酸等招募吞噬细胞（主要为小胶质细胞与巨噬细胞）；并进一步产生“吃我（eatme）”信号，如磷脂酰
总结
近年来，随着转基因小鼠、成像技术和监测手段等的革新，人们对SCI后微环境失衡的认识较过去更为全面和深入；尤其对SCI后免疫微环境失衡的探索更是目前的研究热点。SCI后早期，固有免疫细胞（中性粒细胞、小胶质细胞和巨噬细胞）的大量浸润、持续到亚急性期和慢性期的促炎状态以及适应性免疫细胞造成长时间、强烈的免疫炎症反应导致了免疫微环境的失衡。目前，SCI后各种免疫细胞作用的报道尚存在一些矛盾，这可能归咎于SCI后不同阶段，各免疫细胞亚群的数量和细胞因子的分泌处于动态变化，部分研究无法准确地揭示相应细胞在SCI后的具体作用。此外，非免疫微环境的紊乱也与免疫微环境紊乱相互影响，共同抑制SCI后组织的修复。因此，探索SCI后微环境中各类细胞间多样的相互作用，以及免疫微环境和非免疫微环境之间复杂的相互影响，可为促进SCI后神经元再生和功能恢复提供新的思路和靶点。
来源：中国脊柱脊髓杂志2020年第30卷第10期
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