急性淋巴细胞白血病" target="_blank" title="">急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤，近年随着诊断分型技术的提高及联合化疗的应用，长期生存率已达90%，但复发难治性B系急性淋巴细胞白血病（B-ALL）仍是儿童白血病相关死亡率的重要原因。成人ALL的发病率低但预后差，5年总体生存率不到40%，复发患者预后的平均存活时间只有6个月。以嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞为代表的肿瘤靶向免疫治疗在体外和临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的应用潜力和发展前景，其中以靶向CD19分子的CAR-T细胞（CD19 CAR-T）在治疗复发难治性B-ALL上取得的巨大成功则是目前此领域的一座里程碑。在取得诸多成果后，其存在的问题也逐渐浮出水面。近年来关于治疗后复发的报道层出不穷，更有治疗后CD19转阴的病例出现。本文就这一新兴免疫疗法的复发机制进行探讨。
一、CAR简介
CAR技术的基本原理是通过基因工程技术将识别某抗原分子的抗体可变区基因序列与淋巴细胞免疫受体的胞内区序列拼接后，通过逆转录病毒等载体转染到淋巴细胞内，并表达融合蛋白于细胞表面，通过非主要组织相容性抗原复合物（MHC）限制性的方式识别特定抗原杀伤肿瘤细胞。为了增加CAR在患者体内的持续性及扩散性以提高其抗肿瘤作用，CAR的结构不断被优化，根据增加的共刺激信号元件，如CD28、DAP10、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）等，CAR已从第一代优化到第三代，最新的第四代CAR又称通用细胞因子杀伤重定向T细胞（TRUCKs）。目前应用于临床大多数是第二代CAR，其体内持续性及扩散性明显优于第一代。虽然第三代CAR也已应用于临床，但目前尚无数据表明第三代CAR的抗肿瘤作用优于第二代。
二、CD19 CAR-T在难治复发性B-ALL中治疗进展
CD19作为B细胞肿瘤的标志性靶点，最早出现于晚期祖B细胞和早期前B细胞，在B细胞成熟并最终分化为
目前国内外多个研究机构都在进行CD19 CAR-T细胞治疗的临床实验，其中复发或难治性B-ALL的治疗缓解率约67%~90%。不同研究中CD19 CAR-T治疗患者缓解维持时间也不一，短则维持2个月，长则3年疾病未见复发。但因各研究中患者的选择及治疗前的预处理、CD19 CAR-T的制备、CAR的结构、CAR-T的应用剂量以及临床毒副作用的管理等因素都不尽相同，故很难在不同研究之间进行比较。然而，诸多临床试验均已经证实CD19 CAR-T细胞治疗的安全性及有效性，但是CD19 CAR-T细胞治疗后复发仍是CD19 CAR-T细胞临床治疗中一大挑战。
三、CD19 CAR-T治疗后复发机制
美国国家癌症研究所（NCI）在用CD19 CAR-T细胞治疗20例复发难治性ALL虽取得显著成果，完全缓解（CR）率达70%，但仍有2例患者分别在3个月和5个月之后复发，并且CD19转为阴性。Maude等报道30例儿童及成人ALL采用CD19 CAR-T治疗后，27例患者获得CR，其中7例在CD19 CAR-T治疗后6周至8.5个月期间复发：4例CD19阳性，3例CD19阴性。Grupp等报道2例ALL患者在经过CD19 CAR-T输注治疗后均在1个月内获得CR。其中1例患儿持续缓解，另1例患儿2个月后复发，且复发后肿瘤细胞CD19为阴性。在2013美国血液学会（ASH）年会上，费城儿童医院（CHOP）报道17例患者CD19 CAR-T治疗后，14例（82%）在1个月内实现CR，其中CR患者中有3个复发：2例CD19阳性，1例CD19阴性。
目前研究表明，CD19 CAR-T细胞治疗复发难治性B-ALL后复发存在两种模式：（1）流式细胞技术仍可检测到B系标志物CD19，即CD19阳性白血病复发；（2）流式细胞技术不能检测到B系标志物CD19，即CD19阴性白血病复发。复发的原因可能包括CAR-T细胞在部分患者体内的持续时间短，以及肿瘤抗原表达逃逸变异等。临床研究发现患者外周血的CAR-T细胞减少或者消失，随即出现白血病的复发，往往研究者为防止这部分患者复发，再次追加注射CD19 CAR-T，但维持白血病缓解的效果不一。这也间接说明CAR-T细胞只是暂时控制而没有完全清除白细胞克隆，通过延长T细胞的持久性可以阻止一部分肿瘤复发。研究报道CD19 CAR-T治疗前采用5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine）、依鲁替尼（ibrutinib）、
然而，CD19阴性复发则不能通过延长T细胞的持久性阻止，而且CD19阴性复发对CD19 CAR-T细胞治疗耐受。并且CD19阴性复发占所有CD19 CAR-T治疗后复发的10%~20%。因此，探讨CD19阴性复发机制对CAR-T治疗B-ALL具有非常重要意义。
Grupp等对1例CD19 CAR-T治疗后CD19阴性复发的患儿标本进行细胞流式检测，并与CAR-T治疗前的细胞流式结果对比，结果表明CD19阴性肿瘤为原存在的小克隆，在CD19 CAR-T选择性压力下发展为主导克隆，导致CD19阴性白血病复发。Sotillo等通过对CD19 CAR-T治疗后CD19阴性复发患者CD19基因进行全外显子测序及RNA测序，揭示CD19基因的2号外显子存在多种有意或无意突变，但并没有导致CD19表达沉默，而在选择性剪切的作用下表达缺失2号外显子的截短蛋白，从而不能被CD19 CAR-T识别，并逃逸其杀伤作用耐受CD19 CAR-T治疗。由此通过某种方式靶向干预CD19截短蛋白的表达，可能为临床避免CD19阴性复发提供新思路。
Gardner等运用CD19 CAR-T治疗7例具有混合系白血病（MLL）基因重排的B-ALL患者，患者均获得CR，然而其中2例患者1个月内以急性髓细胞白血病（ AML）复发，包括CD19在内的淋巴系抗原标记均转阴。表明CD19 CAR-T治疗选择下AML克隆耐受CD19 CAR-T治疗，从而发展为优势克隆导致复发。AML克隆可能CD19 CAR-T治疗压力下由原B-ALL肿瘤细胞去分化或非定向前体细胞分化而来，或是原本存在的AML小克隆在CD19 CAR-T的压力性选择下发生克隆膨胀。此报道提示临床CD19 CAR-T治疗MLL-B-ALL，患者容易转化为AML导致复发，CAR-T治疗后CR应尽快采取移植。
Jacoby等通过对小鼠B-ALL肿瘤模型研究表示，CD19 CAR-T作用压力下，可诱导B-ALL肿瘤细胞发生部分或完全的免疫表型改变，引起CD19表达降低或者沉默，从而耐受CD19 CAR-T治疗，并且此过程涉及多种基因表达改变，例如与B细胞相关的重要转录因子Pax5及Ebf1等。
根据以上文献总结CD19 CAR-T治疗B-ALL后CD19阴性复发机制是发生了克隆取代，即CD19阳性克隆被CAR-T清除，CD19阴性克隆发展为主克隆，而CD19阴性克隆的CD19蛋白可能表达沉默或者表达异常，但目前尚不明确CD19阴性克隆出现的机制是原本就存在的小克隆，还是化疗或CD19 CAR-T作用下原肿瘤细胞发生重塑，或者以上机制同时存在。
为了防止CD19 CAR-T治疗后CD19阴性复发，双特异性抗原靶点的CAR-T也许是一个治疗选择。同时采用2个B细胞特异性抗原的CAR，或者一个CAR具有2个特异性的靶点，如CD19/CD20双特异性的CAR，抑或采用2群不同的T细胞分别制备表达不同特异性的CAR 。CD22 CAR-T可以作为一个替代靶向目标，但还需要更多的临床试验进一步探索。
基于诸多临床试验总结，研究者认为目前CD19 CAR-T治疗可能不能单独彻底治愈白血病，但CD19 CAR-T可为造血干细胞移植提供一个宝贵的时间窗。复发B-ALL在二线化疗中大约只有30%的缓解率，而对于难治复发性成人患者，只有5%的患者有机会进行移植，并且伴有微小残留病的患者移植后的效果要远远差于分子学完全缓解患者的效果。因此，CAR-T可通过其强大清除肿瘤的能力使这些难治性患者获得暂时的分子学缓解状态，以创造一个可以进行移植的机会并改善这部分患者的临床预后。对于CD19 CAR-T之后不采取移植的患者，CD19 CAR-T则可能需要体内更长的持续性以防止可能出现复发及免疫逃逸等情况。
四、前景方向
CD19 CAR-T细胞在ALL等血液系统恶性肿瘤早期临床试验显示了不俗的业绩，但治疗后复发及抗原标记转阴仍是今后需克服的难题，目前关于复发机制的研究并不多。根据目前所知复发转阴机制增加相关临床试验的进行，减少CAR-T治疗后复发的概率以增加病患的生存率将成为CAR-T发展的新方向之一。另外其对于实体肿瘤只有非常有限的临床经验，因而研究者必须开发创新的理念来寻找合适的靶目标，克服肿瘤介导的免疫抑制。总之，CAR-T细胞免疫治疗在临床中的应用和推广非常值得期待，在将来是否能作为一种免疫药物成为标准医疗治疗的一部分还需要进一步的努力和探索。
来源：中华医学杂志2017,97(08):629-631
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