肝脏具有显著的再生能力，可在急性肝损伤后恢复原有的质量和功能。然而，慢性肝损伤常导致肝纤维化，扰乱再生和肝功能。肝纤维化普遍存在于慢性肝病中，如非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化和肝癌。然而，目前缺乏针对严重慢性肝病的有效治疗方法或临床批准的肝纤维化药物。治疗慢性肝病的一个有趣策略可能不仅包括抑制纤维化，还包括促进损伤后的肝脏再生。肝星状细胞（HSCs）作为肝脏中主要的间充质细胞，与肝纤维化和再生均相关。近期《Hepatology》发表的一项研究，旨在鉴定HSCs中同时促进再生和抑制纤维化的特定靶点，并阐明其分子机制¹。

本研究使用了pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro（简称PCDH）的慢病毒载体。通过慢病毒感染和嘌呤霉素筛选获得PCDH（空载体作为对照组）和LHX2过表达的细胞。分别收集了约100,000个PCDH和LHX2过表达的LX2细胞，其细胞活力超过90%。为了进行RNA-seq，细胞在Trizol试剂中裂解。经过氯仿提取和异丙醇纯化后，获得了总RNA。为了构建CUT&Tag文库，收集细胞与ConA磁珠孵育。然后，加入LHX2抗体并在4°C孵育过夜。随后在室温下与二抗和pA/G-Tnp转座酶孵育后，基因组被片段化。gDNA通过磁珠提取，然后通过PCR扩增，并纯化产物。最后，使用HiSeq2500 Illumina测序仪分别对RNA-seq和CUT&Tag文库进行双端150bp测序。

肝损伤后HSCs表达与肝细胞增殖和纤维生成显著相关的基因

通过天狼星红染色评估肝纤维化，并在损伤后的多个时间点使用Ki67和Pcna免疫组织化学染色测量再生。结果显示慢性损伤模型中有明显的纤维化，而急性损伤模型中没有。在损伤后的恢复期，急性模型中高表达的基因主要是促再生生长因子，而胶原家族基因在慢性模型中高表达。功能富集分析显示，急性模型中高表达的基因参与器官再生，而慢性模型中高表达的基因与促纤维化过程相关，包括炎症反应的调节和细胞外基质（ECM）组织。在急性损伤模型中，HSCs主要上调促再生因子，包括Hgf、Hbegf、Ngf、Tnf和Fgf12，特别是在恢复期。此外，与静息HSCs相关的基因，如Lrat、Gfap、Ngfr和Ets1，在急性模型的HSCs中显著更高。HSCs中这些促再生和促纤维化特征的差异与肝切片中观察到的病理变化一致，表明HSCs是肝损伤后再生和纤维化的关键调节因子。

HSCs的转录组分析鉴定出可能调节肝脏再生和纤维化的转录因子

研究关注了三个转录因子——Lhx2、Foxf1和Etv1，它们在急性模型中高表达，并且在对乙酰氨基酚（APAP）和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型中显示出可变的调节活性。表达分析显示Lhx2和Foxf1特异性表达于HSCs，暗示它们在肝脏再生和抑制纤维化中起关键作用。接着分析了Lhx2和Foxf1与纤维化（Acta2）和再生（Hgf）标记基因的相关性。与Foxf1相比，Lhx2与这些基因显示出更强的相关性。Lhx2与HSCs的已知标记物Desmin共定位，证实了其在HSCs中的特异性表达。此外，Lhx2表达在再生肝脏中显著增加，特别是在损伤区域。相对于正常肝脏，纤维化肝脏显示较少的Lhx2表达，在纤维化区域甚至没有观察到表达。来自人类肝组织的RNA-seq数据显示，与健康个体相比，纤维化患者的LHX2表达较低。总的来说，研究提出在HSCs中特异性表达的Lhx2/LHX2具有促进肝脏再生和抑制肝纤维化的双重功能。

HSCs中LHX2的调节靶点在肝脏再生和纤维化中富集

研究在LX2 HSC细胞系中进行功能获得实验以鉴定靶点。功能富集分析显示，上调基因与细胞增殖、再生和肝脏发育相关，而下调基因与ECM组织、趋化性调节和细胞迁移相关。结果表明LHX2主要通过motif-1调节HSCs中ECM相关基因的表达。为了评估Lhx2对肝脏再生的调节作用，使用经胆固醇和甲基化修饰的siRNA在CCl4诱导的急性肝损伤模型中敲低Lhx2表达，结果表明Lhx2敲低抑制了肝脏再生并阻碍了肝功能恢复。总之，在小鼠肝脏中使用Lhx2敲低和HSC特异性过表达，证明了Lhx2促进急性肝损伤后的肝脏再生和肝功能恢复。

Lhx2上调HSCs中的促再生因子以促进肝细胞增殖

为了阐明Lhx2对肝脏再生的调节机制，首先确认Lhx2过表达的HSCs是否促进肝细胞增殖。将野生型、对照（PCDH）和LHX2过表达的LX2的上清液加入到培养的人肝细胞HL7702中。结果显示，使用LHX2过表达的LX2上清液可显著增加肝细胞增殖。Ki67免疫荧光进一步证实了这些结果。为了明确Lhx2促肝细胞增殖的关键效应因子，研究人员结合RNA-seq和CUT&Tag数据验证发现，促再生因子HGF、NTF3在LHX2过表达的LX2细胞中表达显著升高。于是研究聚焦于被认为是促进肝脏再生关键因子的HGF。LHX2过表达的LX2及其分泌上清液中HGF蛋白水平均有显著增加，研究还在LX2和原代小鼠HSCs中敲低了LHX2，其中HGF的表达随着LHX2的减少而降低。因此，LHX2主要通过转录调节HSCs中的促再生因子HGF来增强肝细胞增殖。

HSCs中Lhx2过表达抑制慢性肝损伤后的肝纤维化并促进肝脏再生

为了确定Lhx2在肝纤维化中的作用，利用HSCs特异性过表达Lhx2的小鼠构建CCl₄诱导的慢性肝损伤模型，该模型小鼠中过表达Lhx2可显著降低血清ALT和AST水平，表明肝损伤得到部分改善。此外，与对照相比，Lhx2过表达的肝脏表现出更少的坏死区域、减少的纤维化和更低的巨噬细胞浸润，肝组织中的总羟脯氨酸含量也显著下降。纤维化相关基因的mRNA水平，如Acta2和Col1a1，在Lhx2过表达小鼠肝脏中显著降低。这些结果表明，在慢性肝损伤背景下，HSCs中Lhx2过表达抑制了肝纤维化并促进了肝脏再生。

LHX2抑制HSCs的纤维生成、增殖和迁移

HSCs的持续活化常导致肝纤维化。使用HSC细胞系LX2来确定LHX2是否抑制HSC活化。在LX2细胞系和原代小鼠HSCs中，LHX2的稳定和瞬时过表达均抑制了HSC活化相关基因的表达，如COL1A1、COL3A1和Acta2（aSMA）。ASMA的免疫荧光染色显示，LHX2过表达显著减弱了原代小鼠HSCs和LX2细胞中的HSC活化。增殖和迁移是肝纤维化过程中活化HSCs的两个主要特征。通过CCK8实验，发现LHX2过表达显著抑制了LX2细胞增殖。伤口愈合实验证实，与对照相比，过表达LHX2的LX2细胞迁移显著减慢。在敲低LHX2的LX2细胞中，在RNA和蛋白水平均观察到aSMA显著增加。LHX2敲低也显著增强了LX2迁移。总之，LHX2抑制了HSC活化，包括纤维生成、增殖和迁移。

LHX2通过转录上调SMAD6抑制HSC活化

TGF-β信号通路对HSCs的活化至关重要。结果显示，TGF-β刺激导致HSCs中LHX2表达下调。此外，RNA-seq和CUT&Tag分析表明，LHX2对TGF-β信号通路具有抑制性调节作用，涉及上调SMAD6表达。这些结果表明LHX2可能通过TGF-β信号通路调节HSC活化。为了确认LHX2通过转录上调SMAD6表达，进而抑制SMAD2的磷酸化，最终阻断内源性TGF-β信号通路，从而抑制HSC活化。在LHX2过表达的细胞中使用siRNAs进行SMAD6敲低。这种敲低导致HSC活化相关基因显著上调，包括COL1A1、Acta2和COL3A1。尽管LHX2过表达后HGF表达明显增加，但在SMAD6敲低后，LHX2过表达的LX2中的HGF表达并未显著降低。在蛋白质水平，SMAD6敲低逆转了LHX2对HSC活化的抑制作用。总之，这些结果表明LHX2通过转录上调SMAD6表达来抑制HSC活化。

本研究中通过分析急性和慢性肝损伤模型中HSCs的整体和单细胞转录组，鉴定了几种与促再生和抗纤维化功能相关的HSCs转录因子。此外，在小鼠和人类HSCs中特异性表达的转录因子Lhx2，正向调节促再生因子，负向调节纤维化相关基因。在细胞和小鼠模型的HSCs中选择性进行的功能获得和缺失实验证明了Lhx2在HSCs中具有促进肝细胞增殖和肝功能恢复以及抑制HSC活化以缓解肝纤维化的双重功能。此外，研究发现Lhx2通过转录上调HGF表达来增强肝脏再生，通过转录上调SMAD6来阻断内源性TGFβ信号通路，从而抑制HSC活化。这些结果表明Lhx2是一个具有促再生和抗纤维化功能的治疗慢性肝病的潜在靶点。

尽管既往的研究报道了Lhx2与肝纤维化有关，但其在损伤后肝脏再生中的作用尚未见报道。本研究中发现Lhx2通过转录调节促再生因子（特别是HGF）的表达来促进肝脏再生。HGF是一种有丝分裂原，在部分肝切除术和急性肝损伤后的再生过程中刺激肝细胞增殖。HGF主要在HSCs中表达，特别是在静息的HSCs中，这已被最近的scRNA-seq数据分析所证实。Lhx2和HGF在静息HSCs中的调节模式为HSCs促进肝脏发育和维持生理肝脏稳态提供了重要证据。因此，Lhx2不仅是抑制HSC活化的关键转录因子，还参与调节静息HSCs以维持肝脏稳态和再生。

本研究证实，HSCs中特异性表达的Lhx2具有促肝再生、抑肝纤维化的双重功能，且肝损伤前上调静息HSCs中的Lhx2可有效预防肝纤维化。然而，在纤维化肝脏的活化HSCs中上调Lhx2的治疗效果需要进一步研究，这对于肝脏疾病的临床治疗可能更具吸引力。此外，探索调控HSCs中Lhx2表达的上游信号可能为提高Lhx2水平提供新途径。为Lhx2的临床应用开发创新的靶向策略也至关重要。总之，Lhx2在HSCs中的表达对生理和病理肝脏均有有益影响。需要更多的研究来进一步评估Lhx2在临床应用中的可行性和意义。

参考文献

1. Tao J, et al. Lhx2 specifically expressed in HSCs promotes liver regeneration and inhibits liver fibrosis. Hepatology. 2025 Sep 1;82(3):683-701..