肝内胆管癌（ICC）是第二常见的肝癌类型，患者预后较差，5年生存率低于20%，如今，免疫联合化疗已经成为晚期ICC的标准治疗方案。然而，部分患者由于免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的存在，难以从免疫治疗中获益，临床中亟需进一步探索ICC中TME的特征，了解其导致免疫检查点抑制剂疗效不佳的机制。近期，一项发表于Hepatology的研究成功在ICC中识别出两种免疫浸润模式，并为ICC的免疫治疗策略提供了潜在的新靶点^[1]。

TME由多种宿主细胞（如癌细胞、免疫细胞和基质细胞）以及非细胞成分（包括分泌物质和细胞外蛋白）组成。这些因素共同在癌症的发生、发展以及对免疫治疗的反应中发挥重要作用。在TME内部，浸润肿瘤的免疫细胞至关重要，因为这些细胞会与肿瘤细胞相互作用，导致有利（抗肿瘤）或不利（促肿瘤）的结果。目前，对于ICC的TME研究有限，现有研究主要集中关注特定标记物或细胞类型，如PD-L1表达和CD8 T细胞浸润。浸润肿瘤的免疫细胞与肿瘤细胞之间复杂的相互关系尚未被完全阐明，理解这些相互作用对于开发靶向TME的治疗策略至关重要。本次研究中，研究者利用空间转录组学来表征ICC中瘤内免疫浸润的表型，尝试探索导致免疫抵抗的因素。

研究者从中国医学科学院北京协和医学院国家癌症中心/肿瘤医院的预处理患者中获取了70个福尔马林固定石蜡包埋的ICC样本和8个新鲜的ICC样本进行分析。

• ICC中巨噬细胞+ 型和浆细胞+ 型瘤内免疫浸润模式

研究者评估了每个样本的免疫评分，以代表免疫浸润的平均水平，并研究了4个具有显著免疫浸润的样本中瘤内免疫簇的具体细胞组成，其中有2个样本（p3和p5）显示出较高的巨噬细胞标记物CD68表达，在p4和p6中则显示出浆细胞相关标记物（IGHA1、IGHG1、IGHG3以及多聚IgA和IgM的连接链）的高表达。根据这些模式，研究者将样本分为巨噬细胞+ 型和浆细胞+ 型。

为了验证浸润巨噬细胞特征的生物学和预后意义，研究者使用ConsensusClusterPlus包对FU-iCCA队列进行了共识聚类。聚类确定了患者中的两个不同亚群，对比簇2（C2），簇1（C1）显示出浸润巨噬细胞特征基因的更高表达，C1患者对比C2患者的生存结局更差，显示了浸润巨噬细胞特征的预后价。C1还在与增殖（细胞周期和DNA复制）以及促肿瘤特征相关的通路中富集，包括TGFB信号传导、VEGF信号传导和细胞外基质重塑的激活，相反，C2则表现出以白细胞迁移和炎症反应相关通路为标志的强大免疫反应。这些发现支持了MARCO+ 巨噬细胞的促肿瘤作用。MARCO在巨噬细胞+ 型样本中高表达，并且MARCO水平高的ICC患者总生存期更短，表明其在临床结局中具有不利作用。

研究者进一步探索了MARCO在ICC中的表型，通过使用大规模单细胞数据集（GSE125449、GSE138709、GSE151530、GSE181878和测序的8个ICC样本）识别出6个主要细胞群：上皮细胞、髓系细胞、成纤维细胞、内皮细胞、T细胞和B细胞，髓系细胞占总细胞群体的7.3%，其中15.8%为MARCO+ TAMs。MARCO在TAM中的分布验证了其作为典型巨噬细胞标记物的作用。SPP1、RETN和FBP1在MARCO+ TAM中高表达，它们可能促进肿瘤细胞增殖并抑制免疫反应。S100A9和S100A8（Ca²⁺结合蛋白）也在MARCO+ TAM中上调。

通路分析显示，MARCO+ TAM中上皮-间质转化（EMT）活性增强，涉及细胞外基质重塑并促进肿瘤转移。在MARCO+ TAM中观察到血管生成和缺氧增强。免疫抑制通路TGFB信号传导在MARCO+ TAM中也同样增强，免疫相关通路则在MARCO+ TAM中被抑制。

• MARCO+ TAMs对ICC中的TME具有免疫抑制作用

研究者根据整合的单细胞RNA测序数据集中MARCO+ TAMs中位数量将样本分为高MARCO+ TAM组和低MARCO+ TAM组，高MARCO+ TAM组显示出更高比例的恶性细胞和髓系细胞，而T细胞和B细胞较少。在ICC样本上使用MARCO、CD3和CD8进行多重免疫荧光显示，MARCO高表达区域的CD3和CD8表达较少，提示其对T细胞和CD8 T细胞的免疫抑制效应。

研究者整理了与T细胞活性相关的基因，高MARCO+ TAM样本显示出更高的记忆T细胞标记物（如SELL和CCR7）表达，以及免疫检查点PDCD1、CTLA4和TIGIT的表达增加。相反，低MARCO+ TAM样本显示出更高的细胞因子（如IFNG）和细胞毒性标记物（如GZMB）表达。

• 探索ICC TME的潜在治疗靶点

  
  

研究者探索了具有不同瘤内免疫浸润模式的样本的肿瘤细胞表型，以探索潜在的肿瘤-免疫相互作用。在大规模单细胞数据集中提取了肿瘤细胞相对于免疫细胞和正常上皮细胞具有独特性的标记基因，标准为avg_log2FC>0.25且p值<0.05，结果识别出在巨噬细胞+肿瘤区域表达最高的CTSE。验证结果显示，与邻近正常区域相比，CTSE主要在肿瘤细胞中表达，在70名ICC患者中进行的IHC证实了肿瘤细胞中CTSE表达升高，且晚期ICC患者对比早期患者的CTSE水平更高。

研究者检查了CTSE在三种免疫浸润类型样本中的空间表达模式，发现在巨噬细胞+型样本（p3和p5）中，CTSE在肿瘤区域内显示出显著表达，该结果在患者队列中得到验证，CTSE水平高的患者总生存期更短。同时具有高CTSE和高MARCO水平的患者临床结局最差，表明这两种细胞类型之间存在潜在的协同作用。

这项研究对ICC中的瘤内免疫浸润及其空间排列进行了全面的分析，划分了巨噬细胞+ 和浆细胞+ 两个类型，其中MARCO+ TAMs是巨噬细胞+型样本中的主要细胞类型，并与CTSE+ 肿瘤细胞密切相关。这些发现可以指导未来的临床试验，并为治疗策略的开发提供潜在的生物标志物。

研究中还分析了MARCO+ TAM肿瘤具有侵袭性特征的机制，CTSE作为一种来自肽酶A1家族的天冬氨酸蛋白酶，在肿瘤区域与MARCO+ TAMs共同大量表达，可以作为潜在的治疗靶点。

这项研究存在局限性，例如缺乏接受免疫治疗的患者，研究者计划通过构建具有MARCO表达调控的小鼠模型和使用生成CTSE+ 肿瘤细胞的ICC小鼠细胞系来验证本次发现。总之，这项研究揭示了ICC中瘤内免疫细胞浸润模式，并详尽阐明了MARCO+ TAM和CTSE+ 肿瘤细胞的共定位诱导了免疫抑制性TME。