肝内胆管癌（ICC）是第二常见的原发性肝癌，早期症状不明显，60%-70%患者在初诊时已失去手术机会；此外，ICC对放化疗不敏感，一线治疗后中位总生存期（OS）仅约1年，二线治疗后仅6个月；尽管免疫治疗可以改善多种肿瘤的预后，但近半数 ICC 患者对免疫检查点抑制剂（ICIs）的应答率较低，ICC的免疫抑制微环境促进肿瘤免疫逃逸，是免疫治疗效果不佳的关键原因之一。因此，临床迫切需要可用于早期诊断的方法和治疗靶点，以改善ICC患者预后。

肿瘤相关抗原（TAAs）因免疫耐受丧失、蛋白定位异常等因素暴露或递呈，对TAAs 的鉴定与研究，不仅有助于深入理解肿瘤发生发展过程中的生理病理变化及分子机制，还能为靶向治疗提供潜在靶点。而肿瘤相关自身抗体（TAAbs）已被证实可作为肿瘤诊断、病情进展监测及预后预测的生物标志物。

双皮质素结构域蛋白2（DCDC2）属于双皮质素家族。在胆道系统中，DCDC2突变可引发新生儿硬化性胆管炎，但在ICC中的功能与机制完全未知。

人体样本收集：使用3名健康人和3名CCA患者的血清进行HuProt芯片检测。

4个复旦大学队列：

本研究通过细胞实验、动物实验以及一套全面的分析技术（蛋白质芯片、转录组分析、功能实验、免疫荧光、双荧光素酶报告基因实验等）以阐明DCDC2在ICC中的作用和机制。

为研究胆管癌（CCA）相关抗原及自身抗体，我采用HuProt蛋白芯片检测了3例患者（1例ICC患者、2例肝外胆管癌患者）及3例健康供体样本中的自身抗体。数据分析显示，CCA患者血清中存在31种TAAbs。在复旦大学队列I的RNA测序数据及TCGA胆管癌队列（TCGA-CHOL cohort）中，对编码这31种TAAbs的28个对应基因的表达水平进行了分析。在这28个基因中，有10个基因在复旦大学队列Ⅰ和TCGA-CHOL队列中，其在CCA组织中的表达较非肿瘤组织发生显著异常改变。除DCDC2在这两个队列中（CCA/非肿瘤组织）的表达倍数变化排名最高外，CCA组织中DCDC2的mRNA水平也显著升高。此外，对复旦大学队列I和TCGA-CHOL队列中ICC及ECC组织的DCDC2 mRNA水平进行了详细分析，发现DCDC2 mRNA水平仅在ICC组织中特异性上调；在另一个独立的复旦大学队列II中也得到了类似结果。进一步研究显示，在所有正常组织类型（GTEx数据库）及泛癌类型（TCGA数据库）中，DCDC2在ICC组织中呈现组织特异性高表达。另外，我们在复旦大学队列III中检测了DCDC2自身抗体的存在情况，该队列包含健康供体、胆结石患者、胆囊癌患者、ECC患者及ICC患者的血清。与HuProt蛋白芯片的检测结果一致，ICC样本中DCDC2自身抗体水平显著更高。

免疫荧光结果显示，在正常胆管组织中，DCDC2蛋白表达量较低，且主要集中在细胞膜上；而在胆管细胞癌组织中，DCDC2蛋白的表达量显著升高，且分布更不规则。在复旦大学队列IV样本的免疫组织化学染色实验中，也观察到了类似结果。此外，在该队列的ICC患者中，DCDC2蛋白的高表达水平与较差的预后相关。

综上所述，DCDC2蛋白在ICC中过表达，且是ICC的特异性抗原。因此，DCDC2蛋白不仅可作为ICC诊断的生物标志物，在ICC预后评估方面也具有应用优势。

体外实验结果显示，DCDC2可提高ICC细胞的增殖速率，并增强这些细胞的集落形成能力。体内实验进一步证实了DCDC2对ICC细胞促癌性作用，具体表现为肿瘤体积增大和重量增加。另一方面，DCDC2在体外和体内均能促进ICC细胞的转移。

为进一步验证DCDC2对ICC转移的促进作用，将HCCC-9810细胞注射到小鼠脾脏中，建立了肝转移小鼠模型。生物发光成像结果显示，DCDC2在体内可促进ICC细胞的转移；小鼠肝脏染色结果也证实了ICC细胞的转移灶数量显著增多。

集富集分析结果显示，DCDC2高表达可显著激活ICC细胞中的PI3K-AKT信号通路；富集得分最高的生物学过程包括“Hallmark PI3K-Akt-MTOR信号通路”、“KEGG CXCR-GNB/PI3K-Akt信号通路”以及“KEGG KSHV vGPCR-GNB/G-PI3K-Akt信号通路”。

蛋白质印迹实验证实了PI3K-AKT信号通路的激活，在HCCC-9810和HuCC-T1细胞中过表达DCDC2可促进AKT蛋白的磷酸化。当AKT磷酸化抑制剂（perifosine）抑制AKT活性后，DCDC2过表达无法再促进ICC细胞的增殖或迁移；与此一致，Transwell实验也表明，perifosine可消除DCDC2过表达对ICC细胞迁移和侵袭能力的促进作用。

单细胞RNA测序分析显示，在DCDC2高表达与低表达样本中，肿瘤内免疫细胞的比例相似。对人源化小鼠模型异种移植瘤的RNA测序数据进行基因富集分析发现，多个免疫增强通路受到下调，这些通路涉及自然杀伤细胞活化、T细胞活化及相关细胞因子的产生。

相应地，研究人员在DCDC2过表达的HCCC-9810细胞系RNA测序数据，以及人源化小鼠模型中DCDC2过表达异种移植瘤的RNA测序数据中，分析了免疫检查点经典配体的mRNA水平，结果发现，在这两个数据集中，纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）的mRNA水平均显著上调。此外，在TCGA-CHOL队列中，DCDC2与FGL1的mRNA水平呈强正相关。在13例ICC肿瘤样本中，通过实时qPCR检测显示DCDC2与FGL1的表达呈正相关。以上结果提示，DCDC2可能通过调控下游效应分子FGL1影响肿瘤免疫。

既往研究已证实，FGL1是淋巴细胞活化基因3（LAG-3）的主要免疫抑制配体。FGL1与LAG-3的相互作用可抑制CD8+T细胞功能并促进肿瘤免疫逃逸，且该过程不依赖于程序性死亡受体1/程序性死亡配体1（PD-1/PD-L1）通路。

在DCDC2过表达的ICC细胞中，FGL1的表达水平显著升高，具体表现为：mRNA水平上调、细胞内蛋白水平增加、细胞培养上清液中蛋白含量升高。这一结果提示，FGL1调控的CD8+T细胞功能可能深度参与DCDC2介导的ICC抗肿瘤免疫应答过程。此外，与DCDC2低表达组相比，DCDC2高表达组中CD8+T细胞分泌的多种细胞毒性细胞因子水平有所降低。在DCDC2过表达组的异种移植瘤和同种异体移植瘤中，CD8+T细胞的颗粒酶B和干扰素γ水平也降低，表明这些组织中的CD8+T细胞功能受到抑制。

采用抗DCDC2抗体，在ICC组织中进行了免疫共沉淀联合质谱分析。在已鉴定出的与DCDC2相互作用的蛋白质中，根据得分独特肽段的数量排名，ENO1位居前列。在ICC细胞中，过表达DCDC2可提高ENO1的蛋白水平，而敲低DCDC2则会降低ENO1的蛋白水平。蛋白质降解实验表明，过表达DCDC2可延长ENO1蛋白的半衰期。在ICC中，观察到过表达DCDC2后，FBXW7与ENO1的结合亲和力降低，同时ENO1的泛素化水平也随之下降。这些结果提示，FBXW7可能参与了DCDC2介导的ENO1泛素化抑制过程。

ENO1是一种具有多种生化功能的“兼职蛋白”，在多种癌症中是AKT磷酸化的关键调控因子。在ICC野生型细胞系中敲低ENO1后，AKT的磷酸化水平显著降低。回复实验结果显示，敲除ENO1可消除DCDC2诱导的AKT磷酸化增强效应。集落形成实验和CCK8实验证实，敲除ENO1可减弱DCDC2诱导的ICC细胞增殖能力增强效应。Transwell实验也表明，敲低ENO1可抑制过表达DCDC2的ICC细胞的迁移和侵袭能力。综上，这些结果证实，ENO1是DCDC2介导的ICC细胞致癌功能的下游效应因子，在其中发挥关键作用。

审批编号：CN-171822

有效期至：2026/11/18

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