作者：姜鸣欣，周怡君，孙宏晨，吉林大学口腔医院病理科

异位骨化(heterotopic ossification， HO)是指在骨骼肌、筋膜、肌腱、韧带等骨骼外的软组织中形成骨组织的复杂病理过程。HO可分为两大类型：获得性和遗传性。获得性HO多见于临床，可以在肌肉骨骼创伤、关节手术、中枢神经系统损伤甚至烧伤后出现。

创伤可导致颞下颌关节的周围形成异位骨，从而引发颞下颌关节强直，致使患者张口功能受限，甚至是面部畸形。遗传性HO较为罕见，包括纤维发育不良骨质增生症(fibrodysplasia ossificans progressiva， FOP)和进行性骨质异质增生症(progressive osseous heteroplasia， POH)。FOP由激活素A受体1(activin A receptor type 1，ACVR1)基因突变引起，ACVR1是骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein， BMP)的受体。

FOP患者临床表现为局部肿胀、疼痛、活动减少、僵硬和发热。POH是一种常染色体显性疾病，有研究表明GNAS1基因杂合失活突变可引起该病，该病与FOP的区别在于存在皮肤骨化，没有先天性骨骼畸形。

异位骨形成包括四个阶段：炎症、软骨形成、成骨和异位骨成熟。炎症是异位骨形成的启动开关，在免疫系统中巨噬细胞是响应和解决炎症的关键细胞，并具有多种表型分化，这与其受微环境影响从而发生代谢改变息息相关。本文对HO发生发展中巨噬细胞糖代谢重编程进行探讨，为HO的治疗研究提供新思路。

1. HO的发病机制及病理过程

虽然目前对HO发病机制的认识尚不清楚，但是研究表明获得性HO的形成具备3个条件：局部微环境、成骨的前体细胞、成骨诱导物及其信号传导通路。根据获得性HO形成过程又分为炎症期、成软骨期、成骨期和骨成熟期。

首先严重创伤导致炎症反应和局部低氧微环境的形成，此时炎症细胞聚集，进而成纤维细胞聚集增生、纤维化，并形成有利于软骨生成的低氧张力环境，增强缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor， Hif)-1α的稳定性，并产生多种血管生成因子，促进新生血管生成；同时正常骨组织内的细胞向周围软组织释放多种成骨诱导因子，并激活转化生长因子(transforming growth factor， TGF)-β、BMP等多种信号通路，招募原始的间充质干细胞(msenchymal stem cells， MSCs)首先分化为成软骨细胞，形成软骨，待氧含量逐步提高，软骨细胞成熟肥大和钙化，分泌胶原基质，然后胶原基质逐步重塑和骨化，形成成熟的骨组织。

2. 巨噬细胞是HO炎症的重要媒介

炎症是多种生理和病理过程的基础，是机体对于组织功能失调或稳态失调做出适应性反应的生理根源。爆炸伤、烧伤、脑损伤和一些外科手术可引起获得性HO，而这些严重损伤往往伴随着剧烈的炎症。P物质(substance P，SP)-1是一种能够促进MSCs成骨分化的神经炎症肽，主要由巨噬细胞分泌。在爆炸导致HO的大鼠模型中，可以观察到受伤肢体中的外周释放的神经递质SP-1的数量增多，并且爆炸伤诱发参与软骨生成、成骨、伤口愈合、组织修复和脂肪生成等相关基因在截肢部位明显过度表达。

严重创伤后，炎症介质释放导致收缩期血管堵塞，造成组织血液循环障碍从而引发缺氧微环境。Hif-1α是细胞适应缺氧的一个关键媒介，可以上调BMP和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)的表达，诱导MSCs的软骨以及成骨分化和血管生成，最终导致HO。

此外，因中枢神经系统和脊柱的严重创伤而产生的炎症是神经源性异位骨化(neurogenic heterotopic ossification， NHO)发展的一个重要因素。脊髓损伤(spinal cord injury， SCI)小鼠模型中，Ly6C高表达(Ly6Chi)炎症单核细胞/巨噬细胞在受伤肌肉中浸润增加，表达促炎细胞因子抑瘤素M(oncostatin M，OSM)。

OSM是白介素(interleukin， IL)-6细胞因子家族的成员，可以由单核细胞、巨噬细胞和骨细胞分泌。巨噬细胞衍生的OSM通过与MSCs上的糖蛋白130(glycoprotein 130，GP130)/OSM受体(OSM receptor， OSMR)复合物结合后，通过激活JAK1/2使STAT3酪氨酸磷酸化，促进NHO的发生。

除了上文提到的由于损伤导致的获得性HO外，FOP患者也存在明显的促炎状态。Chakkalakal等在ACVR1 R206H突变的小鼠模型中发现，巨噬细胞和肥大细胞等免疫细胞浸润于异常骨组织形成的部位。在FOP患者外周血检测出，IL-3、IL-7、IL-8和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF)升高。免疫细胞分泌的炎症因子可以诱导骨形成基因表达、血管生成和缺氧微环境，从而促进组织中的软骨和骨形成。总之，炎症是HO的关键触发因素。

巨噬细胞在炎症的启动和解决中发挥双重作用并有多种分化表型，大体上可分为经典激活的巨噬细胞(也称为M1)和交替激活的巨噬细胞(也称为M2)，起到调节早期和晚期炎症反应的作用。Sorkin等在烧伤肌腱切开术小鼠模型中发现不同表型的巨噬细胞浸于HO处，并且产生TGF-β1的巨噬细胞与HO和异常软骨祖细胞分化有关。

高水平的TGF-β1通过TGF-β1-Smad2/3途径诱导MSCs的成骨分化，促进HO的发生和发展。Olmsted-Davis等发现与HO相关的棕色脂肪细胞样细胞是M2巨噬细胞，并且用氯膦酸盐脂质体处理巨噬细胞后可以有效抑制异位骨组织的形成和HO的发展。此外，M1和M2巨噬细胞都能分泌BMP，并间接增强BMP的表达。BMP通过BMP/Smad和p38 MAPK信号通路促进MSCs增殖和分化为软骨和骨组织，从而参与HO的发育。

有研究报道，在骨关节炎中早期M1巨噬细胞分泌大量炎症因子并使软骨细胞凋亡，而后期M2巨噬细胞促进软骨成熟和异位骨形成。还有研究表明M1巨噬细胞在分泌VEGF和肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)等炎症因子后促进血管生成，而M2巨噬细胞稳定血管生成。

此外，M2巨噬细胞可以在受损的肌肉中调节内皮间充质转化(endothelial-mesenchymal transition， EndMT)，抑制M2的形成可能导致TGF-β/Smad信号传导的异常激活，从而诱导小鼠的EndMT，促进受损肌肉组织的血管重塑，导致胶原蛋白的积累和纤维化组织对肌肉的替代。因此，可能需要在炎症的早期阶段适当维持或扩大M2，以防止EndMT过度活动和HO。

综上所述，巨噬细胞对HO生成的影响可能取决于不同表型的作用时间和持续时间。

3. HO不同阶段中巨噬细胞的糖代谢重编程

巨噬细胞响应微环境中的不同刺激，快速改变其表型，使它们在骨骼肌再生过程中发挥不同的功能，包括促炎期的消退和向再生期的过渡。急性损伤后不久，入侵的巨噬细胞为促炎表型，吞噬细胞坏死组织并分泌生长因子，营造有利于卫星细胞活化和增殖的环境。最近的研究发现，巨噬细胞拥有独特的代谢特征，这与其功能状态相关，称为代谢重编程。

正是因为巨噬细胞的高度可塑性，当它在病理过程中受到不同程度影响时，巨噬细胞也可能成为许多骨代谢疾病的根源，如HO和骨关节炎，这将为预防和治疗HO提供策略。

3.1 HO早期M1极化巨噬细胞糖代谢特点

在平衡状态下，巨噬细胞表现出的新陈代谢特征与主要通过三羧酸(tricarboxylic acid， TCA)循环利用葡萄糖和线粒体氧化磷酸化(oxidative phosphorylation， OXPHOS)产生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate， ATP)相一致。HO早期即炎症期，M1巨噬细胞的代谢调整特点是减少TCA循环的利用和减少OXPHOS，同时增加葡萄糖到乳酸的代谢(糖酵解)以及增强磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway， PPP)。而M1巨噬细胞的这种适应改变在不缺氧时就可以发生，因此被称为“有氧糖酵解”或“沃伯格效应”。

3.1.1 糖酵解与Hif-1α通路

与M0巨噬细胞相比，M1巨噬细胞的代谢特点是糖酵解通量增加，线粒体OXPHOS减少。在炎症或缺氧状态下，呼吸链复合体Ⅰ的电子通过辅酶Q直接传递给邻近复合体Ⅱ，复合体Ⅱ接受电子后，催化从延胡索酸到琥珀酸的逆反应，并把电子储存在琥珀酸中。此时膜电位降低，ATP产生不足，线粒体的能量产生受到抑制；糖酵解能够在线粒体受到抑制时提供ATP以维持能量供应。

Wang等研究表明，人类和小鼠模型的早期炎症性FOP病变是明显缺氧。缺氧不仅增加BMP配体依赖性信号的强度，而且通过Hif-1α介导的机制延长ACVR1在信号体内的持续时间，通过药物抑制Hif-1α，可以减少异位骨形成。在HO小鼠模型中对代谢物变化的分析表明，糖酵解的关键产物——丙酮酸和1，6-二磷酸果糖，在HO的早期阶段都比对照组高，但在接近骨形成时下降到对照组水平。

巨噬细胞等免疫细胞通常出现在有着低氧水平的炎症部位。因此，转录因子Hif作为巨噬细胞适应缺氧条件的关键媒介，在HO中发挥着重要作用。Hif-1α主要参与M1极化。M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase isoform M2，PKM2)促进丙酮酸代谢为乳酸，而不是进入TCA循环。PKM2可以作为Hif-1α的共同激活剂，增加Hif-1α的转录活性，从而增加糖酵解酶的转录，进而增强糖酵解代谢。

此外，PKM2还是Hif-1的靶点，表明PKM2和Hif-1信号传导之间存在正反馈回路。脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)介导PKM2磷酸化，促进核内PKM2/Hif-1复合物的形成，此复合物可以驱动IL-1表达。更值得注意的是，有研究指出PKM2也能促进STAT3的核定位，并作为一种蛋白激酶直接磷酸化和激活核STAT3，组成型活性STAT3还能够诱导Hif-1蛋白水平长期增强并促进有氧糖酵解。

总之，糖酵解以不同方式驱动炎症巨噬细胞反应。

3.1.2 PPP途径

M1巨噬细胞还能增强PPP。PPP是从糖酵解分支而来，是葡萄糖代谢的第一步。糖酵解中间代谢产物6-磷酸葡萄糖可脱氢生成6-磷酸葡萄糖酸；反过来，6-磷酸葡萄糖酸又可被6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶脱氢，生成核酮糖-5-磷酸，这是细胞生长和增殖所必需的核苷酸和氨基酸的前体。

此外，该途径还是还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH)的主要来源。NADPH用于NADPH氧化酶产生活性氧(reactive oxygen species， ROS)，也是生成抗氧化剂谷胱甘肽和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase， FAS)所必需的。

碳水化合物激酶样蛋白(carbohydrate kinase-like protein， CARKL)是一种色酮糖激酶，可限制PPP。Haschemi等发现，当LPS诱导的巨噬细胞活化时，CARKL的表达量会显著减少，从而诱导促炎因子的产生。

3.1.3 TCA中间产物的积累

M1极化代谢重编程的另一个典型结果是TCA循环几个层次的通量中断及中间产物的积累。柠檬酸盐在M1中大量增加，柠檬酸盐可能通过柠檬酸盐载体(在M1中上调)从线粒体转运到细胞膜，并通过ATP柠檬酸盐裂解酶(ATP citrate lyase， ACLY)转化为草酰乙酸盐和乙酰辅酶A。

Davis等对小鼠HO模型进行代谢组学分析，发现早期柠檬酸盐含量增加。柠檬酸盐的输出和分解与巨噬细胞中一氧化氮(NO)、ROS和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的产生有关，这在清除病原体的过程中起着关键作用。此外，乙酰辅酶A也是组蛋白乙酰化的一个重要辅助因子。

组蛋白乙酰化是一种表观遗传学修饰，可调节基因表达的特定模式，通过ACLY依赖性的乙酰辅酶A产生，是柠檬酸盐代谢与基因转录之间的一种新的联系。这种联系可能是驱动抗炎巨噬细胞转录的一个重要因素，因为IL-4增加ACLY表达、核乙酰辅酶A的产生以及抗炎基因产物亚群启动子中组蛋白的乙酰化。

在促炎巨噬细胞中高表达的免疫反应基因1(immune-responsive gene 1，IRG1)通过催化TCA循环代谢产物顺式乌头酸的脱羧作用产生衣康酸。研究表明，衣康酸似乎是一个负反馈环，用于解决过度的炎症反应，衣康酸盐是琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase， SDH)的内源性竞争性抑制剂，SDH的抑制可防止琥珀酸氧化为富马酸盐，从而防止复合物I驱动的线粒体ROS的产生。

此外，衣康酸通过破坏Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1，KEAP1)与核因子红细胞系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2)的半胱氨酸结合，从而抑制氧化应激；衣康酸还可以抑制IκBζ，阻断核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路的激活。

在炎症巨噬细胞中，TCA循环在琥珀酸转化为延胡索酸时发生中断。在正常生理状态中，电子通过电子传递链(electron transport chain， ETC)的复合体Ⅰ或复合体Ⅱ传递给复合体Ⅲ，最后电子在复合体Ⅳ传递给氧气。然而在炎症状态下，启动了反向电子运输，电子传递给琥珀酸。

SDH又是ETC中的复合体Ⅱ，将TCA循环和OXPHOS直接联系起来，所以SDH受到抑制会导致琥珀酸水平的增加。在细胞膜内，琥珀酸已被证明可抑制脯氨酰羟化酶结构域蛋白(prolyl hydroxylase domain proteins， PHDs)的活性，PHDs通常可促进Hif-1α的降解。在线粒体中，积累的琥珀酸可以抑制电子链复合物Ⅰ的活性，这导致ROS产生增加。

ROS还可以抑制细胞膜上的PHDs， 从而进一步稳定Hif-1α，增加糖酵解基因的转录。小鼠HO模型中，琥珀酸盐在BMP2诱导后的第二天增加，也证明了早期HO中缺血缺氧的存在。琥珀酸盐可以在细胞外积聚，与琥珀酸盐受体1(succinate receptor 1，SUCNR1)结合，并与Toll样受体协同诱导巨噬细胞的激活，增强炎症细胞因子的产生。

3.2 HO晚期极化M2巨噬细胞糖代谢特点

3.2.1 OXPHOS的增强

在组织修复阶段，M2巨噬细胞有完整的TCA循环和高效的OXPHOS。与糖酵解相比，OXPHOS产生的ATP较高但较慢，可维持较长时间，从而为修复组织稳态和创伤提供源源不断的细胞生物能量。

3.2.2 PPP的减少

CARKL是人类和鼠类M1巨噬细胞激活的抑制因子，可将景天庚酮糖磷酸化为景天庚酮糖-7-磷酸，从而刺激该循环的非氧化阶段，这减少了NADPH的产生，抵消M1典型的ROS产生。CARKL对PPP的调节至关重要，在M2中的表达增加，而在M1中则减少。M2除了糖代谢的改变，M2巨噬细胞还表现脂肪酸氧化途径的增强。有研究表明脂肪酸合成酶可通过促进OXPHOS来促进M2激活。此外，谷氨酰胺代谢也在M2巨噬细胞中发挥着重要作用。

4. 总结与展望

HO包含一系列有序的步骤，由异常组织愈合和再生的损伤引起，丰富的巨噬细胞被招募到HO部位并促进HO的进展。长期以来，巨噬细胞激活代谢过程一直是许多人感兴趣的领域，尽管我们对驱动巨噬细胞极化的代谢分子事件的理解仍然非常模糊，但目前的证据表明，代谢中间产物的作用比预期的重要得多。

进一步了解巨噬细胞代谢程序的灵活性是如何被控制的，外部(即微环境)和内部信号如何调节可诱导和可逆的代谢程序，以及在炎症激活和炎症解决过程中巨噬细胞的代谢和转录网络是如何联系的，这对于更好地理解巨噬细胞可塑性和巨噬细胞生物学功能至关重要。

基于这个观点，对HO进行代谢组学分析可以为研究HO提供新的见解。如果通过操纵代谢传感器(如羧基端结合蛋白1)或调节器(如PKM2或CARKL)可以实现巨噬细胞的表型转换，从促炎症转变为较少炎症，甚至修复性巨噬细胞的表型，这是否对HO的发生发展有影响，则有待进一步研究。

来源：姜鸣欣,周怡君,孙宏晨.异位骨化中巨噬细胞的糖代谢重编程[J].口腔生物医学,2024,15(01):53-58.

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