作者：梁湘萍，王兆亿，邱锡坚，刘风华，广东医科大学附属医院妇科，广东省妇幼保健院生殖健康与不孕专科
胚胎着床是新生命形成的关键步骤，这一过程的顺利完成需要高质量的囊胚、处于种植窗时期的子宫内膜以及母胎界面间的友好互动，三者缺一不可。尽管体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer， IVF-ET）技术日渐成熟，但反复种植失败（recurrent implantation failure， RIF）仍然困扰着全球约10%的IVF-ET患者［1］。目前，学术界尚未就RIF的确切定义达成共识。现阶段被广泛认可的定义是Coughlan等［2］在2014年提出的“40岁以下的IVF-ET女性，在3个新鲜或冷冻周期内移植至少4枚优质胚胎后，未能实现临床妊娠的情况”。中国最新的RIF临床诊治专家共识则建议将此定义适时更新为“40岁以下成年女性在3个新鲜或冷冻周期内移植至少3枚优质胚胎后仍未能实现临床妊娠，其中优质胚胎包括：第3天胚胎（细胞数≥8个、卵裂球大小均匀、碎片率＜10%）和囊胚（≥3BB）［3］”。泛素化是指泛素在一系列酶的催化作用下共价结合到靶蛋白的过程。它作为蛋白翻译后修饰的一种方式，在配子发生和早期胚胎发育中起着关键作用［4］。泛素-蛋白酶体途径不仅参与了哺乳动物早期妊娠期间的子宫重塑［5］，而且还可以通过调节基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的表达参与小鼠的胚胎植入［6］。尽管已有部分研究证明胚胎植入过程涉及泛素化，但是泛素化是否与胚胎植入过程中的免疫调节相关，暂未有充分的研究。
本研究从公共数据库基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中下载了RIF相关的转录组和单细胞测序数据集，通过多组学分析揭示了RIF子宫内膜中不同细胞类型之间的异质性，并在细胞亚群水平上研究RIF的关键驱动基因和信号通路，为RIF的发病机制提供新的见解。
01资料与方法
1.1 研究对象 从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载GSE111974、GSE26787和GSE223672数据集，其中GSE111974、GSE26787为健康对照组与RIF患者的子宫内膜转录组数据集，GSE223672为单细胞测序数据集。每个数据集中的患者年龄均小于38岁，且卵巢功能正常。对照组患者为至少有1次成功活产且没有流产、其他妇科疾病或药物使用史的个体。所有患者均在种植窗期间（LH+7~LH+9）接受了子宫内膜搔刮术。本研究已通过广东省妇幼保健院伦理委员会批准（伦理审批号：医伦第202401203号）。
1.2 方法
1.2.1 筛选RIF泛素化相关差异表达基因与功能富集分析 使用“limma”包来识别对照组与RIF之间的差异表达基因，设定阈值为P＜0.05和log Fold Change （FC）＞1。将筛选得到的RIF差异表达基因与泛素化相关基因取交集，得到在RIF中差异表达的泛素化基因。利用R包“ClusterProfiler”对这些交集基因进行基因本体（Gene Ontology， GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）分析，阈值为P＜0.05和q＜0.05。通过基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis， GSEA）进一步分析交集基因高低表达组之间的信号通路差异情况。
1.2.2 通过机器学习进一步筛选关键基因 采用LASSO回归对得到的差异泛素化基因进行进一步筛选，以得到具有良好分类性能的RIF关键基因进行模型构建。在纳入每个特定基因的表达值后，构建每个患者的风险评分公式，并在LASSO回归分析中用其估计的回归系数加权，根据风险评分公式计算每个患者的评分。通过绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic， ROC）曲线来评估模型的准确性。
1.2.3 单细胞RNA测序数据分析 使用Seurat包来处理数据。采用t分布随机邻域嵌入算法（t-distributed stochastic neighbor embedding algorithm， t-SNE）对细胞亚群进行可视化。通过celldex包和SingleR包对细胞亚群进行注释，随后分析RIF关键基因在各个细胞亚群中的表达情况。
1.2.4 免疫细胞浸润分析 采用单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis， ssGSEA）来评估免疫细胞在每个子宫内膜组织样本中的相对丰度［7］。同时，采用Spearman相关性分析来探究RIF关键基因与免疫细胞之间的关联。
02结果
2.1 RIF组与对照组之间差异泛素化基因的筛选及功能富集分析 将GSE111974作为训练集并对其进行差异分析，在RIF与对照组样本之间筛选出412个差异表达基因（P＜ 0.05，|logFC|＞1），其中243个表达上调，169个下调（图1a）。随后从GeneCards数据库中获取了相关性评分>5的泛素化相关基因。通过绘制差异表达基因和泛素化基因的韦恩图，筛选出12个差异泛素化基因（图1b）。GO分析显示，差异泛素化基因主要参与MAPK级联反应以及蛋白激酶活性的反向调节等生物学过程，主要表现的分子功能为泛素-蛋白转移酶活性、泛素-蛋白连接酶活性等（图1c）。KEGG分析表明，差异泛素化基因参与了铂耐药和泛素介导的蛋白水解过程（图1d）。
2.2 LASSO回归筛选RIF的基因标志物 基于上述得到的12个差异泛素化基因，采用LASSO回归对训练集GSE111974进一步分析，筛选关键基因。交叉验证的误差图和确定基因系数的图形分别如图1e和图1f所示。当λ=0.0002481927时，KLHL13、UCHL1、TOP2A和USP33的系数不为零。将这4个基因作为后续研究的关键基因并构建RIF预测模型，模型公式如下：风险评分=KLHL13×（−0.0663535941322533）+UCHL1×（-0.0425267978675594）+TOP2A×（-0.0108969836137476）+USP33×0.5116
2.3 RIF患者子宫内膜的单细胞RNA测序分析 RIF子宫内膜中的所有细胞可分为18个亚型（图2a）。这18个亚型主要被划分为5个细胞簇：上皮细胞、组织干细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell， NK cell）、内皮细胞和间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs）（图2b）。TOP2A在MSCs中表达量最高，USP33主要在MSCs和内皮细胞中表达，而在NK细胞、组织干细胞和上皮细胞中表达较少（图2c）。
2.4 免疫浸润分析 健康受试者和RIF患者子宫内膜中免疫细胞的比例如图3a所示。Spearman相关性分析显示Th1细胞和Th2细胞（r=0.67，P＜0.05）以及CD8+T细胞（r=0.63，P＜0.05）之间存在强烈的正相关关系。辅助性T细胞与Th2细胞呈负相关（r=−0.1，P＜0.05）（图3b）。检查点分子与肿瘤浸润淋巴细胞（r=0.93，P＜0.05）、趋化因子（r= 0.9，P＜0.05）和T细胞共抑制（r=0.95，P＜0.05）呈显著正相关（图3b）。T细胞共抑制和肿瘤浸润淋巴细胞水平也呈正相关（r=0.9，P＜0.05）（图3b）。就免疫细胞类型而言，RIF组中CD8+T细胞、中性粒细胞、Th1细胞、Th2细胞和调节性T细胞的水平显著低于对照组（P＜0.05），而辅助性T细胞的水平显著较高（P=0.003）（图3c）。与对照组相比，RIF组的抗原呈递细胞（APC）共抑制、APC共刺激、趋化因子、检查点分子、人类白细胞抗原、促炎、主要组织相容性复合体Ⅰ类、促炎、T细胞共抑制、T细胞共刺激和肿瘤浸润淋巴细胞均受到抑制（图3c）。
此外，本研究还观察了关键基因与免疫细胞之间的相互作用。KLHL13的表达与促炎、肿瘤浸润淋巴细胞浸润、APC共刺激等呈显著正相关（图3d）。TOP2A和UCHL1表达与T淋巴辅助细胞浸润呈强烈负相关（图3e，f）。USP33表达与Th2细胞、APC共刺激、T细胞刺激和促炎细胞浸润呈负相关（图3g）。
2.5 关键基因的GSEA分析 为了探索这些关键基因参与RIF的潜在途径，本研究利用GSEA分析4个关键基因富集的具体信号通路。结果显示，KLHL13主要涉及趋化因子、Hedgehog和NF-κB信号通路。UCHL1参与DNA复制、Hedgehog和Wnt信号通路。TOP2A参与DNA复制、GnRH和p53信号通路。USP33的表达与apelin信号通路、趋化因子信号通路和核苷酸代谢相关。综合来看，这些关键基因与胚胎发育和细胞再生密切相关。
03讨论
RIF病因复杂，目前尚缺乏明确的诊断标志物和有效的治疗方案。本研究通过分析RIF患者的转录组和单细胞测序数据，旨在寻找新的RIF诊断标志物并探究它们与免疫细胞浸润的关系。
本研究主要聚焦于RIF病理发展过程中泛素化的作用。KLHL13、UCHL1、TOP2A和USP33是我们筛选得到的与RIF密切相关的4个关键基因。UCHL1编码的是一种在神经系统中高表达的去泛素化酶。它调节哺乳动物配子发生过程中的凋亡相关因子，并与卵母细胞成熟、精子发生以及精子-卵子结合密切相关［8］。最近的一项报告指出，UCHL1在小鼠子宫发育中发挥着关键作用，其缺失会导致小鼠不孕［9］。TOP2A是一种DNA拓扑异构酶，能在
GSEA结果表明，特征基因主要与胚胎发育、DNA复制、细胞增殖与分化以及炎症反应相关，其中涉及Hedgehog和Wnt信号通路。Hedgehog信号通路是控制胚胎发育的经典信号通路［13］。Indian Hedgehog（Ihh）对于正常
单细胞测序结果显示，在子宫内膜不同细胞群体中，关键基因的表达模式存在显著差异。TOP2A在子宫内膜MSCs中的表达远高于其他细胞群，KLHL13则主要表达在子宫内膜MSCs和组织干细胞。KLHL13是构成泛素连接酶复合物的成分之一［16］，且参与维持细胞有丝分裂［17］。MSCs能进行自我更新以及多向分化，细胞增殖分裂活跃，DNA复制和转录频繁，这可能是TOP2A和KLHL13主要表达于MSCs的原因。我们推测，TOP2A和KLHL13在RIF患者子宫内膜中的总体表达下调，同时会影响其在子宫内膜MSCs和组织干细胞中的表达，导致子宫内膜干细胞的增殖或分化异常，子宫内膜自我修复更新的能力受损，从而引发RIF。
既往研究报道RIF与母体子宫内膜的免疫平衡失调有关［18］。胚胎滋养层的入侵是一个复杂的过程，牵涉到子宫内膜基质细胞、巨噬细胞、子宫自然杀伤细胞［19］等多种细胞之间的相互作用。它们释放多种细胞因子，一同构建了蜕膜的免疫微环境，在妊娠过程中起着免疫抑制和免疫营养的双重作用。因此，窗口期的子宫内膜免疫失衡可能是RIF发生的重要因素。本研究的免疫细胞浸润分析结果提示肿瘤浸润淋巴细胞与T细胞共抑制分子之间有非常强的正相关性。肿瘤浸润淋巴细胞是肿瘤间质中的异质性淋巴细胞，大多数情况下以CD4+、CD8+T细胞为主，还包括CD3+、FoxP3+T细胞。先前一项研究收集了复发性流产（recurrent miscarriage，RM）、RIF和健康妊娠女性黄体中期的子宫内膜［20］，分析发现RM和RIF患者的子宫内膜T细胞群明显区别于健康妊娠女性。RM和RIF患者内膜中CD3、CD4、CD8+T细胞的数量均有明显增加，而FoxP3+T细胞显著减少。这些结果表明，胚胎的成功植入需要足够的FoxP3+T细胞来维持母体的免疫耐受。Guo等［21］发现RIF患者血清中Th1/Th2比例增加，与Kuroda等［22］的研究结果相一致。这些发现表明免疫系统失调在RIF发病机制中的重要性。
本研究存在一些局限性。首先，研究只进行了生物信息学分析，并没有在体内或体外对关键基因进行实验验证。其次，单细胞测序数据集的样本数量有限，无法充分反映RIF患者分泌期子宫内膜的状况。
综上所述，本研究基于转录组和单细胞测序数据的综合分析，采用机器学习的方法，筛选了与反复种植失败相关的关键基因。同时，本研究也探讨了关键基因在RIF患者子宫内膜细胞群中的表达模式以及它们与免疫浸润的关系。这些特征基因在预测RIF方面表现良好，并为理解其分子发病机制提供了线索。
参考文献 略
来源：《中国实用妇科与产科杂志》2024年8月 第40卷 第8期
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