作者：马丽娜,漆海宁,秦 莹,刘 洋等,山东中医药大学附属医院,山东中医药大学博士后流动站,黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江中医药大学,江西省妇幼保健院

人子宫内膜是一个复杂的组织,动态经历周期性生理变化,以响应卵巢分泌的性激素。女性未怀孕时,子宫内膜随着雌孕激素水平的波动经历以下阶段:增殖期、排卵期、分泌期和月经期[1]。在整个月经周期的大部分时间里,胚胎无法附着在子宫内膜上,除了分泌中期一个非常短的自限性时期,此时子宫内膜获得特定和短暂的状态,允许胚胎黏附、侵入,子宫内膜这种能接纳胚胎植入的能力叫子宫内膜容受性(endometrial receptivity,ER)[2],这一时期通常被称为“着窗”(window of implantation,WOI)[3]。ER缺陷或异常易导致着床失败,早期妊娠丢失甚至复发性流产。据报道[4],子宫内膜容受性欠佳和母胎界面交互对话异常导致了人类2/3的着床失败,严重阻碍了IVF的成功。因此,深入全面研究ER形成机制和调控因素,识别与ER相关的靶点分子,是协助诊断妊娠相关子宫内膜源性疾病亟待解决的瓶颈问题。

尽管当前评估ER的方法有子宫内膜组织学检测、超声、基因组学等手段[5],但其准确性和可重复性备受争议。随着人类基因组计划的完成,分子生物学研究进入了后基因组时代[6],蛋白质组学技术应运而生,其可实现在整体水平上分析蛋白质的组成、结构、表达、修饰状态以及蛋白质之间的相互作用和联系,提供特定时刻和特定状态下细胞内分子的全面视图。其在揭示疾病的分子机制、发现新型生物标志物以及作为特异性诊断方法、预后预测因子和治疗靶点等方面提供了可靠的数据支持。通过对分泌期子宫内膜蛋白表达谱的研究,得到与ER相关的特异性蛋白,可更深入地掌握子宫内膜容受性调控的分子机制,并提高子宫内膜容受性异常的诊断准确性和可靠性。

1 子宫内膜容受性及其影响因素

子宫内膜容受性是指子宫内膜在分泌中期发生形态、生化和功能上的改变,以促进胚胎的附着、侵袭和发育。对于子宫内膜容受性分子机制,目前较为统一的说法是雌孕激素结合其同源受体调控下游靶基因,同时协同细胞因子、黏附分子和趋化因子等众多因子,对子宫基质和上皮细胞的增殖和(或)分化进行有序调控[7]。良好的子宫内膜容受性是胚胎植入的关键性因素。ER异常可导致流产、不孕等一系列生殖问题。目前,干扰ER的因素尚未明确,主要与子宫解剖形态异常、母体免疫异常、内分泌因素、医源性因素、微生物群紊乱有关[8-11]。基于以上原因,子宫内膜无法获得容受性或子宫内膜容受性异常,易导致胚胎植入失败。因此,深入全面研究子宫内膜容受性形成机制和影响因素,对于提高辅助生殖技术的成功率和开发新的不孕症治疗方法至关重要。

2 蛋白质组学及其技术

蛋白质是生命活动的主要载体和功能的真正执行者,只有从蛋白质组学层面对所有蛋白质进行全面系统的研究,才能更贴近对生命现象及本质的掌握。因此,在后基因组时代,大规模分析的蛋白组学研究极大地提升人们对基因功能的理解高度。从整体、动态的角度研究蛋白质的结构和功能信息,以期揭示和阐明生命活动的本质和基本规律,以及为疾病的病理机制、早期诊断、防治药物的研发等提供理论参考。传统的蛋白质组学分析技术是基于色谱的蛋白质纯化技术。目前已研发出多种高级的蛋白质组学分析技术,包括蛋白质微阵列、双向凝胶电泳、质谱、非标记定量(label-free)蛋白质组学技术等[12-13]。与其他技术相比,label-free技术有以下特点:(1)成本耗费低:蛋白质无需标记,所需样本蛋白总量少;(2)周期短:无需复杂的标记步骤,操作简单,耗时短;(3)适用范围广:不受样品条件限制,几乎可对任何物种的各类蛋白质进行鉴定;(4)要求高:对液相色谱分离及串联质谱坚定的稳定性和重复性要求较高,需有足够的技术重复以确证结果的可靠性[14]。

3 蛋白质组学技术在人生理、病理状态下的子宫内膜容受性中的应用

子宫内膜的“组学”研究既复杂又充满挑战性,因为子宫内膜受循环激素和自分泌/旁分泌/近分泌因子的调节,同时结合个体的遗传和环境背景,可能导致不同的生物学反应。蛋白质组学已广泛应用于生殖医学领域的诊断和预后标记物的鉴定。目前已经报道了一系列人月经不同时期子宫内膜的蛋白质组学研究,主要集中在容受前期和容受期的生理性子宫内膜的差异性表达蛋白,以及子宫内膜疾病状态下的蛋白质组学变化。通过构建月经周期不同时期蛋白表达图谱,对比子宫内膜容受性正常、减退患者的蛋白表达差异,有助于了解子宫内膜容受性和胚胎植入的分子机制,对进一步指导临床诊疗具有重要意义。

3.1 蛋白质组学技术在生理性子宫内膜的应用研究

3.1.1 增殖期与分泌期生理性子宫内膜差异表达蛋白的比较 Byrjalsen等[15]首次基于人子宫内膜活检组织,利用2D对增殖期和分泌期的内膜进行蛋白质组学分析,结果显示细胞骨架相关蛋白,如波形蛋白、原肌凝蛋白、角蛋白、微管蛋白、增殖细胞核抗原和β半乳糖苷结合凝集素,主要在增殖期合成,可能与增生期子宫内膜细胞分裂率高有关;而能量代谢相关的肌酸激酶链B、分层蛋白和21K肿瘤蛋白则在分泌期高表达,提示子宫内膜细胞在分泌期发生更多的功能变化。Paule等[16]通过蛋白质组学分析发现,跨膜蛋白Podocalyxin(PCX)在分泌中期的管腔上皮中下调,这种下调在体外受孕激素的调控,提示这种下调可促进子宫内膜容受性。另外,Segura-Benitez等[17]对原代人子宫上皮内膜细胞h PEECs分泌的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)进行蛋白质组学分析,发现囊泡中含有218种蛋白质,其中82种与ER和着床有关。这些蛋白参与细胞黏附、分化、通讯与迁移等,且EVs囊泡中最丰富的蛋白质包括膜联蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)、纤维连接蛋白1(fibronectin,FN1)、整合素αV亚基(integrin subunit alpha V,ITGAV)、玻连蛋白(vitronectin,

VTN)和前纤维蛋白1(profilin-1,PFN1)。随着蛋白质组学技术的革新和发展,LC-MS联用不同定量方法进一步提高了蛋白质组学技术的分辨率和结果重现性。Chen等[18]首次利用LC-MS联合Label free蛋白质组学法发现,与增殖期(月经第7~9d)相比,分泌期(排卵后7d)子宫内膜中有317个差异表达蛋白,揭示了人生理性子宫内膜容受性的关键分子机制(如能量代谢上调和黏着斑下调)。

3.1.2 分泌早期与分泌中期生理性子宫内膜差异表达蛋白的比较 为揭示子宫内膜容受性的分子机制,不少研究单独选取分泌期子宫内膜,比较分泌早期和中期蛋白表达谱的差异。Li等[19]采用2D-DIGE联合MALDI-TOF-MS技术比较可育健康女性同一月经周期中分泌早期(排卵后2d)和分泌中期(排卵后7d)的子宫内膜蛋白表达谱,结果显示共鉴定出31个与着床过程相关的差异表达蛋白,可分为细胞迁移或同化、免疫调节、凝血或纤溶系统等功能类别。Hu等[20]首次应用i TRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)比较了分泌早期(排卵后2d)和分泌中期(排卵后7d)子宫内膜的蛋白表达变化,结果显示共鉴定出173个差异表达蛋白(differentially expressed proteins,DEPs),并首次将容受前期和容受期子宫内膜组织的转录组学和蛋白质组学数据进行整合分析,确定了一组与信使RNA(messenger-ribonucleic acid,mRNA)和蛋白表达变化一致的蛋白。此外,ACSL4被鉴定为ER的一种新的潜在调节因子,并可能成为反复着床失败(repeated implantation failure,RIF)病因,有力推进了对控制ER复杂机制的理解。以上研究对于内膜的提取是采用子宫内膜活检术,由于其是一种侵入性操作,致其在临床中的应用受到限制。近年,有研究使用子宫抽吸法或灌洗法收集内膜,用子宫内膜液(富含蛋白质的液体)进行蛋白质组学分析。如Bhutada等[21]研究了从容受前期(排卵后2d)到容受期(排卵后7d)子宫液体的蛋白成分,结果发现HMGB1水平显著下降,其推测可能是为了确保严格控制胚胎所诱导的促炎反应。

3.2 蛋白质组学技术在病理性子宫内膜中的应用研究

3.2.1 多囊卵巢综合征 多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一种常见内分泌紊乱,通常影响妇女的生殖能力,导致不孕。PCOS相关性不孕主要是由于排卵障碍或无排卵所致。ER受损可能是PCOS患者不良妊娠结局的一个重要原因。因此,研究PCOS子宫内膜蛋白质组谱有助于理解其发病机制和治疗PCOS导致的不孕症。朱宇等[22]应用LC-MS/MS技术比较PCOS和非PCOS女性分泌期子宫内膜组织的蛋白质表达谱,发现色氨酸代谢、酪氨酸代谢和苯丙氨酸代谢等过程中的蛋白表达发生显著改变,这可能是PCOS子宫内膜容受性下降的发病机制。Zhang等[23]通过SDS-PAGE技术探讨了PCOS患者和生育正常对照组的子宫内膜蛋白质组学差异,共鉴定出391个差异表达蛋白,以上差异蛋白主要涉及铁死亡和线粒体功能障碍,因此揭示了子宫内膜自身异常可能在PCOS女性生殖障碍中发挥重要作用。然而,另一项研究[24]进一步将PCOS女性分为排卵性、无排卵性PCOS,另外纳入生育正常的健康人,采用2DPAGE比较三组子宫内膜的蛋白质组学谱,结果显示差异表达蛋白主要涉及细胞周期调节、细胞转运和信号转导、DNA修复、凋亡过程和线粒体代谢。以上研究结果不一致,可能原因是研究纳入的PCOS表型异质性较大。Li等[25]应用LC-MS/MS技术比较PCOS和健康生育女性分泌期子宫内膜组织的蛋白质表达谱,发现DEPs主要涉及能量代谢、炎症和细胞黏附分子,并认为能量代谢可能影响胚胎着床,而炎症和细胞黏附因子可能影响子宫内膜转化和容受性。

3.2.2 复发性流产 复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)影响着约1%计划妊娠的夫妇,至少50%的夫妇没有明确潜在病因[26]。为系统和全面研究RSA的发病机制,寻求更可靠、有效的治疗方案,近年来国内外学者越来越多地将蛋白质组学用于RSA的病因学研究。Metwally等[27]首次使用蛋白质组学研究RSA女性着床期子宫内膜蛋白表达及BMI对子宫内膜的可能影响,结果显示相比健康对照组,RSA女性子宫内膜中触珠蛋白链显著下调;此外,相比于BMI正常的RSA患者,肥胖RSA患者子宫内膜中结合珠蛋白显著上调。此项研究也提示了控制混杂因素和严格要求受试者纳入标准在蛋白质组学分析中的重要性。Wang等[28]的蛋白质组学研究发现,RIF患者容受期的子宫内膜组织中82个蛋白表达水平与非RIF女性组有显著差异,55个DEPs上调、27个DEPs下调。功能富集分析发现这些显著变化的DEPs主要涉及水解酶活性、血液微粒和酶抑制剂活性的负调控,揭示了子宫内膜免疫微环境可能导致RIF。Yang等[29]应用i TRAQ技术比较RIF女性与生育对照组容受期子宫内膜的蛋白表达谱,结果表明与正常孕妇子宫内膜相比,RIF患者子宫内膜组织中存在263个DEPs,主要富集于核糖体亚基和代谢过程中。此外,通过全自动蛋白免疫印迹定量分析系统分析和免疫组化染色以及其他已发表的数据库进一步验证,AZGP、HSD17B2、S100A13和TPPP3在RIF患者中的表达模式,揭示TPPP3和HSD17B2可能是诊断和治疗RIF的有效靶点。Zhao等[30]初步对RIF患者进行种植窗期内膜蛋白质组学测定,发现与反复植入成功女性相比,RIF女性中有625种差异表达蛋白,主要富集到Wnt信号通路、血管平滑肌收缩、泛素化蛋白水解等通路。

3.2.3 子宫内膜异位症 子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是育龄期女性不孕和痛经的常见原因。识别EMs患者子宫内膜的蛋白分子差异是了解EMs的发病机制和开发相关不孕不育和疼痛的新策略的重要一步。目前,蛋白质组学在EMs内膜中的研究较为广泛,几个标志性蛋白已被鉴定为EMs的诊断标记物。研究[31-32]发现,可作为EMs的蛋白标记物有膜联蛋白A4(Annexin A4)、膜联蛋白A2(AnnexinA2)、载脂蛋白A1(apolipoprotein A1,APOA1)。蒋亚玲等[31]研究发现,EMs患者的种植窗期(排卵日后第6d)子宫内膜中Annexin A4较非EMT对照组显著下调。Fowler等[32]研究也发现,EMs患者内膜上的Annexin A2表达显著低于对照组。另外,EMs作为炎症相关性疾病,炎症相关的APOA1在EMs患者内膜中显著下调。Li等[33]将转录组学与蛋白质组学联系起来,并在患有EMs女性血浆中发现了两种差异表达蛋白。然而,在ELISA验证后,只有丝氨酸蛋白酶抑制剂家族C成员1(serpin family C member 1,SERPINC1)在患有EMs女性的血浆中被证明显著降低。因此,SERPINC1可能是EMs检测中一种有用的生物标志物。

4 结语

子宫内膜容受性的建立是成功妊娠的关键阶段,涉及激素、分子和细胞机制的复杂相互作用。对于子宫内膜容受性的影响因素、评估手段和治疗方法仍在不断探索发展中。蛋白质组学广泛应用于人生理、病理状态下子宫内膜容受性的研究中,一些与子宫内膜容受性相关的标志性蛋白相继被挖掘,有助于了解子宫内膜容受性和胚胎植入的分子机制,对进一步指导临床诊疗具有重要意义。然而,既往与子宫内膜容受性相关的差异表达蛋白重复性较低,其原因除了测序技术局限外,还与试验设计及实验方法不同、研究对象异质性较大、样本量不一、样本采集时间、采集方式及存储方法不一致等诸多因素有关,未来仍需大规模的前瞻性对照试验验证。

参考文献略。

来源：现代妇产科进展2024年6月第33卷第6期 

(本网站所有内容，凡注明来源为“医脉通”，版权均归医脉通所有，未经授权，任何媒体、网站或个人不得转载，否则将追究法律责任，授权转载时须注明“来源：医脉通”。本网注明来源为其他媒体的内容为转载，转载仅作观点分享，版权归原作者所有，如有侵犯版权，请及时联系我们。)