作者：张熙佳，白吉伟，北京天坛医院神经外科；李明轩，北京市神经外科研究所
近年来，二代测序（Next-generation sequencing，NGS）技术的发展推动了在基因和表观遗传水平理解肿瘤发生和发展的进展。基于脊索瘤组织的全基因组测序显示，颅底脊索瘤是突变率最低的肿瘤类型之一。在BAI 等进行的80 例颅底脊索瘤全基因组测序中，发现PBRM1 是惟一高频突变的驱动基因，PBRM1 是调节染色质重塑的重要基因，这表明：表观遗传失调可能在脊索瘤中发挥重要作用。
表观遗传调节（epigenetic regulation）是指与DNA序列变化无关的基因表达的调节，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA 的转录后基因调控。DNA甲基化在正常发育和细胞生物学中起着至关重要的作用。1983 年，FEINBERG 和VOGELSTEIN首次证明DNA低甲基化存在于人类实体瘤中，且在肿瘤转移的病人中表现出更大程度的低甲基化，这表明异常DNA 甲基化对肿瘤的发生和发展具有重要影响。
探究脊索瘤的异常DNA 甲基化谱有助于进一步了解其表观遗传机制，并可以基于差异甲基化谱进行诊断、分型与判断预后。本文对脊索瘤的DNA 甲基化的研究进展进行回顾分析。
1. 脊索瘤的异常DNA 甲基化模式
1.1 DNA 甲基化的分子基础
DNA 甲基化是指在甲基转移酶（DNA-methyltransferase，DNMT）的催化下，CG二核苷酸（CpG）胞嘧啶环的第5 位碳原子上添加一个甲基形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。在人类基因组中，约有2800 万个CpG位点，这些CpG位点分布并不均匀。70%的CpG 位点散在分布，这些位点在正常体细胞内通常被甲基化修饰；另一部分有大量CpG 位点聚集的区域被称为“CpG 岛（CpG islands，CGI）”，通常位于基因启动子区域。
与基因组不同的是，在正常体细胞内，位于CGI 内的CpG位点通常是未甲基化的，这为转录因子提供一个可结合平台来控制基因活性。在肿瘤发生和发展过程中，正常的表观遗传过程被破坏，特征表现为全基因组的低甲基化伴CpG 岛启动子区域的DNA高甲基化。
1.2 脊索瘤的DNA低甲基化
目前认为整体DNA低甲基化会导致基因组不稳定和非整倍体增加，并在少数情况下导致沉默癌基因的激活。在脊索瘤中即表现为广泛的DNA低甲基化。ALHOLLE 等对脊索瘤和髓核对照样本进行全基因组DNA甲基化分析时，首次分辨出两者之间共有8819 个（2.9%）显著差异的甲基化位点，其中低甲基化的基因（66.5%）是高甲基化基因（33.5%）的2 倍。
广泛的基因组不稳定通常伴随着在癌细胞中观察到的DNA甲基化的整体丢失，两者之间的因果关系有待进一步确认。肿瘤中单个基因的DNA低甲基化十分罕见，通常受DNA甲基化缺失影响的启动子属于组织特异性基因。RINNER 等最早通过AITCpG360 甲基化检测，发现9 个高/低甲基化基因，包括C3、XIST、TACSTED2、FMR1、HIC1、RARB、DLEC1、KL 和RASSF1。ALHOLLE 等的研究表明脊索瘤与正常对照中存在364 个肿瘤特异性高甲基化位点以及29 个低甲基化位点。
BALUSZEK等在研究启动子甲基化与基因表达之间的关系时，发现Brachyury基因（也称TBXT 基因，其表达产物Brachyury 蛋白是脊索瘤的病理诊断标志物）的高表达与启动子低甲基化相关，这与一项研究干细胞的分化和恶性转化的结果一致，干细胞标志物Brachyury 的失活与其CGI 启动子的进行性甲基化有关。
同时，其研究还发现部分高免疫浸润的脊索瘤中PTPRCAP 启动子上游的cg12044599 探针的低甲基化，PTPRCAP是T细胞和B细胞活化的关键调节因子。尚未发现有活性的去甲基化酶参与肿瘤中的低甲基化，也没有明确证据表明DNMT活性在肿瘤中降低；相反，这些酶（DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b）可能在多种肿瘤中过表达并与肿瘤抑制基因（tumor suppressor genes，TSG）强结合，导致TSG启动子区高甲基化，脊索瘤中低甲基化的基础仍有待进一步研究。
1.3 脊索瘤的DNA高甲基化
CGI 的高甲基化在肿瘤中十分常见，与肿瘤抑制基因、控制细胞生长的基因和下游信号通路的沉默相关。DNA甲基化可以抑制基因表达的机制主要有：①DNA甲基化会产生物理屏障，阻止某些转录因子与启动子结合位点结合。②DNA 甲基化之后甲基化CpG 结合域蛋白结合，进而招募组蛋白去乙酰化酶，使
LONGONI 等报道13 例脊索瘤样本中TNFRSF8 基因的甲基化状态，发现7 例样本中存在与该基因转录沉默相关的DNA甲基化。RINNER等通过比较健康人和脊索瘤病人血液的甲基化模式发现脊索瘤中存在已知肿瘤抑制基因（RASSF1、KL、HIC1 等）的DNA 高甲基化。此后，在脊索瘤中发现更多因DNA高甲基化而沉默的抑癌基因，并认为其可作为肿瘤诊断和预后的标志物。
在脊索瘤中，启动子区获得高甲基化的基因参与多种重要的细胞通路。例如，细胞周期相关基因RASSF1（Ras-association domain family 1），其位于3p21.3 染色体区域，编码一种类似于RAS 效应蛋白的蛋白，可与DNA修复蛋白XPA相互作用，还可以抑制细胞周期蛋白D1 的积累，诱导细胞周期停滞，该基因的表达缺失或表达异常与多种癌症的发病机制相关。
RASSF1 在多种肿瘤中呈现高甲基化状态，是目前肿瘤中描述最频繁的甲基化基因。另一种与细胞周期相关的基因CDKN2A 位于9p21 染色体区域，是细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂，编码p16（INK4a）蛋白，可调控细胞周期影响细胞周期蛋白依赖激酶（CDK4/6 等），在70%的脊索瘤中显示出同型或杂合性缺失。
CDKN2A 在不同类型的肿瘤中表现出DNA甲基化介导的基因沉默，然而在大多数脊索瘤病例中，CDKN2A 表达的缺失与启动子甲基化无关，仅一个病例CDKN2A 显示出明确的启动子甲基化，表明启动子甲基化可能是一小部分脊索瘤中CDKN2A基因沉默的机制。O6- 甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（O6-methylguanin-DNA methyltrans-ferase，MGMT）是一种DNA 修复酶，其基因定位于10p26，能够修复由烷化剂药物引起的DNA烷基化损伤。
在正常细胞中，MGMT启动子区域常处于低甲基化或非甲基化状态。MGMT 甲基化与多种肿瘤发展相关，MARUCCI 等在研究MGMT 启动子甲基化与复发之间的关系时发现，具有MGMT 启动子甲基化的病人均复发，而在非复发脊索瘤中其启动子为未甲基化，提示这一分子特征可能与脊索瘤的侵袭性有关，有助于帮助临床医师制定更佳的治疗策略并预测预后。
同时，MGMT 基因的启动子甲基化可以预测
1.4 DNA甲基化与其他表观遗传调控的相互作用
DNA甲基化可能与其他表观遗传调控方式相互作用。微小RNA（microRNAs，miRNA）是一类长度约为22 个核苷酸的长链非编码RNA，在基因转录后调控中发挥重要作用。近年来，越来越多的数据表明miRNA在脊索瘤中表达失调，存在受DNA甲基化调控的可能性。HAI 等从机制上阐明脊索瘤细胞中LncRNA XIST 的上调降低了miR-1243p 的表达，进而促进p53 凋亡刺激蛋白抑制物（iASPP）的表达，且与病人的不良预后显著相关。而XIST 在脊索瘤中表现为低甲基化，为LincRNA XIST 在脊索瘤中上调提供新的机制。
另外，既往研究表明：H3K27 去甲基化酶抑制剂在人类脊索瘤细胞系和原发脊索瘤样本中可以抑制TBXT 的表达，这提示脊索瘤中Brachyury 基因上调可能是多种表观遗传机制的共同作用。因此，脊索瘤组织中DNA 甲基化与其他表观遗传修饰相互关联还有待进一步研究。
2. 具有预后价值的DNA 甲基化分型
目前，脊索瘤的分类主要基于其组织学特征，2021 年WHO按组织病理学将脊索瘤分为传统型、差分化型和去分化型3 种不同形态的亚型。脊索瘤病人的临床预后差异较大，切除程度相同并且术后均接受放射治疗的脊索瘤仍可能表现出不同的再生速度，10%的病人存活不到1 年，1/3 的病人存活超过20 年。这提示临床或分子因素不能可靠预测其结局，目前亟需可靠的生物标志物及预后组织学特征来改善脊索瘤病人的临床预后。
近年来，肿瘤表观遗传学领域快速发展，DNA甲基化特征可以用来准确对中枢神经系统肿瘤进行分类，不同肿瘤类型具有其独特的DNA 甲基化谱。ZUCCATO等基于68 例肿瘤组织样本中甲基化变异最大的CpG 位点进行K-mean 共识聚类分析，首次确定两种基于DNA 甲基化的脊索瘤亚型，其具有独立于临床因素的预后价值。
随后通过评估每个亚型中具有低甲基化基因启动子的重要通路发现，临床预后较差亚型的通路主要与免疫和转录/翻译相关，且具有较高比例的免疫细胞，因此被称为“免疫浸润”亚型；而预后较好的亚型通路包括细胞间相互作用、细胞外基质、血管生成和代谢通路等，同时具有更高的肿瘤纯度，因此被称为“细胞”亚型。
相比之下，HUO等根据可变甲基化CpG位点对46 例肿瘤样本进行聚类分析，据此将颅底脊索瘤分为亚型1 和2，随后通过分析不同亚型的免疫特征，发现亚型1具有较低的ESTIMATE 评分和免疫评分，以及较高的肿瘤纯度；而亚型2 则高浸润适应性免疫和固有免疫细胞，且免疫细胞比例高的亚型2 病人具有更好预后。以上研究提示：免疫成分在DNA甲基化分型中的预后作用。
相比之下，BALUSZEK 等基于全基因组DNA甲基化谱对32 例颅底脊索瘤样本和4 例髓核进行聚类分析，发现表现为全基因组低甲基化伴CGI 高甲基化的脊索瘤C 以及普遍高甲基化的脊索瘤I，两个亚型之间的免疫浸润状态和免疫细胞含量也存在差异，但并未显示出与生存显著相关。既往研究结果说明：颅底脊索瘤的拷贝数状态具有预后价值。BAI 等研究发现脊索瘤中体细胞拷贝数变异（copy number alterations，CNA）十分广泛，22q 染色体缺失与无复发生存显著相关。
BALUSZEK等使用EPIC微阵列生成的数据进行DNA 拷贝数分析，发现脊索瘤C 更受DNA 拷贝数改变的影响。其中最常见的畸变是9p 染色体臂缺失，其包含CDKN2A 和CDKN2B 基因，是关键的细胞周期抑制因子，提示细胞增殖在脊索瘤C亚型发病机制中起重要作用。同样，HUO等和ZUCCATO等研究发现CNA主要发生在一种甲基化亚型，其中10q/9q/14q 的缺失仅见于“细胞”亚型。
3. 基于DNA 甲基化的液体活检
目前对于
循环游离DNA（circulating cell free DNA，cf-DNA）中有多种类型的DNA改变，包括点突变、微卫星不稳定、DNA高甲基化和杂合性丢失，其中包含由恶性肿瘤主动或通过凋亡和（或）坏死释放到血液中的循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ct-DNA），其能直观反应体内肿瘤细胞的发生及进展。因此，研究脊索瘤病人外周血、血清或血浆中发现的cf-DNA/ct-DNA，有助于脊索瘤的诊断和疾病检测。
ZUCCATO 等利用游离细胞甲基化DNA 免疫沉淀和高通量测序技术获得cf-DNA，可以对脊索瘤、
基于DNA甲基化的液体活检具有潜在的临床价值，针对血液中甲基化异常的cf-DNA/ct-DNA，需要开发更灵敏的检测技术使液体活检成为无创、快速和可重复的早期肿瘤检测方式，有望代替肿瘤组织活检这种侵入性的检测方法。
4. 基于DNA 甲基化的治疗
与遗传改变不同，DNA甲基化具有可逆性。抑癌基因的异常DNA甲基化可以作为肿瘤表观遗传治疗的靶标，应用甲基转移酶抑制剂使这些基因去甲基化并激活，进而抑制肿瘤。例如应用去甲基化药物
基于DNA甲基化的脊索瘤亚型之间存在的分子差异，不同亚型可能对特定的治疗有不同的潜在反应。BALUSZEK 等研究表明免疫浸润与CDKN2A 缺失呈负相关，因此，免疫疗法和细胞周期抑制剂可能在不同类型脊索瘤中产生不同效果。
近年来，包括Brachyury 疫苗和免疫检查点抑制剂在内的免疫治疗被广泛探索，免疫细胞成为治疗脊索瘤的潜在靶点，因此，免疫治疗可能对“免疫浸润”型和脊索瘤I 亚型病人更有益。相反，在脊索瘤C亚型中，细胞周期调控因子和CDKN2A的缺失提示细胞周期靶向治疗的有效性。CDKN2A缺失会导致细胞周期蛋白依赖激酶4/6（CDK4/6）的固有负调节因子p16/INK4a 蛋白的缺失，使CDK4/6 和Rb 通路普遍激活，因此使用CDK4/6 抑制剂palbociclib 可以降低各种脊索瘤细胞系的增殖。在临床中根据不同的脊索瘤亚型选择免疫疗法或细胞周期抑制剂成为潜在的治疗方向。
5. 展望
脊索瘤的基因低突变率提示表观遗传修饰在疾病的分子生物学中发挥重要作用，全基因组甲基化模式改变是脊索瘤的显著特征。目前主要基于微阵列和测序平台来评估全基因组DNA甲基化的表观遗传模式，然而基于微阵列的甲基化谱的周转时间长，以及对于大规模和复杂的数据集、低信噪比和DNA 甲基化数据中的缺失值处理的需求，越来越需要应用高级统计、机器学习方法和深度学习等技术支持。
海德堡的Deutsches Krebsforschungszentrum（DKFZ）基于DNA 甲基化开发了一种肉瘤分类工具，随后LYSKJAER 等利用986 个独立的骨和软组织肿瘤数据集和对照的DNA甲基化进行验证，其中脊索瘤的诊断灵敏度为85%。VERMEULEN等基于机器学习开发的神经网络分类器可以利用稀疏的甲基化谱在1.5h 内实现术中对肿瘤进行分类。这些新兴的深度学习工具可能在未来的DNA 甲基化分析中发挥关键作用，并有望指导外科医生的治疗策略，改善病人预后。
总之，深入研究DNA 甲基化对完善脊索瘤表观遗传学调控机制，寻找诊断生物标志物，判断预后与确定治疗靶点等均具有重要意义。
来源：张熙佳,李明轩,白吉伟. DNA甲基化在脊索瘤中的研究进展[J]. 中国微侵袭神经外科杂志,2024,28(1):50-55.
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