作者：邢利，任明君，唐石伏等，广西中医药大学研究生学院，柳州市人民医院/广西医科大学附属柳州市人民医院检验科

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是东 亚和东南亚（包括中国南方地区）流行的地方性恶 性肿瘤之一［1］ 。据世界卫生组织最新统计，中国人 群 NPC 发病率明显高于世界平均水平，新发病例 数占全球总 NPC 人数的 46.91%。NPC 对放射治 疗敏感，因此随着放疗技术的不断提高，目前早期 NPC 的 5 年总生存率（overall survival，OS）已达到 90％［2］ 。在临床诊疗中，由于 NPC 发病部位隐匿， 发病症状体征与其他良性疾病的难以鉴别，70% NPC 患者确诊时已处于中晚期，转移和复发风险 显著升高，死亡率急剧上升，预后不好［3］ 。目前发 病机制尚不明确，现广泛认为 NPC 是宿主细胞、EB 病毒（Epstein⁃Barr virus，EBV）感染和肿瘤微环 境等因素长期相互作用、不断演化的结果［4］ 。其中 EBV 被公认为是 NPC 的主要危险因素［5］ ，因此与 EBV 有关的生物标志物常被应用于临床辅助诊断 NPC。本文通过分析各种 EBV 相关标志物与早期 NPC 的相关性，以帮助阐明其在早期 NPC 分子诊 断方面的成就和不足。

1 EBV 血清抗体与 NPC

 EBV 是由 Epstein 和 Barr 在 1964 年发现的一 种结构为双链线性 DNA 的人类 γ 疱疹病毒，长约 172 kb，主要通过唾液传播，以潜伏感染的形式存 在人 B 淋巴细胞和鼻咽上皮细胞中，与 NPC 等多 种疾病密切相关［6］ 。EBV 生存周期分为潜伏期和 裂解期，而裂解期又分为立即早期、早期、病毒 DNA 复制期和晚期。不同时期表达相应的蛋白如 潜伏膜蛋白 1（Latent Membrane protein 1，LMP1）、 BZLF1（BamHI Z left frame 1）基 因 编 码 的 Zta （BZLF1 transcription activator，Zta）蛋 白 、BRLFl （BamHI Z left frame 1）基因编码的 Rta（replication and transcription activator）蛋白、早期抗原（Early antibody，EA）等。美国学者 Old 等［7］ 使用免疫扩 散实验最先证实了 EBV 抗体与 NPC 有关。 1976 年曾毅院士团队首次建立了免疫酶法 用于检测衣壳抗原（capsid antigen，VCA）IgA 和 EA⁃IgA，随后的大规模的血清学普查和追踪观察 发现两种抗体联合检测对 NPC 的早期诊断具有重 大意义［8］ 。但单一抗体检测早期 NPC 时 EA⁃IgA 敏感性低，而 VCA⁃IgA 特异度较低。此外 EBV 抗 体谱中，机体对潜伏基因编码的蛋白产生的免疫 应答产物 Rta ⁃IgG 对于早期 NPC 的具有较高准确 性［9］ ，而 Zta 蛋白抗体需要大规模临床应用才能评 价。EBV 核抗原（nucleus antigen，NA）作为 NPC 增殖后期产生的结构蛋白，对早期 NPC 诊断也具 有一定的价值。YU 等［10］ 发现在早期患者血清中， EBNA1⁃ IgA 的灵敏度和特异度分别为 0.778 和 0.969。而 LIU 等［11］ 在 106 例早期 NPC 患者血浆中 检 测 到 EBNA1 ⁃ IgA 敏 感 性 为 0.915，特 异 性 为 0.987，同时提出单一的 EBNA1⁃IgA 有望成为早期 NPC 有前途的标记物。以上的 EBV 血清抗体敏感 性和特异性均较高，但是阳性预测值多在 1%~5%， 因此单一抗体在早期 NPC 筛查及诊断应用中依然 存在局限性。

2 血浆 EB 病毒

DNA 血浆中 EBV⁃DNA 可能是从 NPC 细胞凋亡 过程中释放，或由病毒复制产生。Lo 等［12］运用 RT ⁃qPCR 技 术 检 测 NPC 患 者 血 浆 中 EB 病 毒 EBNA⁃1 和 BamHI⁃W 两个片段的拷贝数，发现晚 期患者血浆中 EBV⁃DNA 拷贝数明显高于早期患 者，认为血浆 EBV⁃DNA 定量快速、准确，适用于 高危地区鼻咽癌的筛查。随后，多个实验室将单 拷贝数的 EBNA⁃1 基因以及多拷贝数的 BamHI⁃W 基因作为检测对象，使用多种检测技术如 qPCR、 dPCR 等检测由 NPC 细胞凋亡释放出的 EB 病毒 DNA 片段（＜181个bp）。然而不同的实验室，不同 的样品处理方法、不同的检测方法对 EBV⁃DNA 的 检出率均有影响。随后在 2011 年世界卫生组织发 布了第一版 EB 病毒扩增技术的国际标准［13］ 。 大量学者将EBV⁃DNA应用于NPC的早期诊断 及筛查中，其中 Chan 等［14］ 应用血浆 EBV⁃DNA 筛查 无症状患者并对第一次阳性的患者 4 周后再次取血 浆进行检测，仍呈阳性的309名受试者经病理确诊的 NPC 患者共 34 例，早期占 71%。作为一项前瞻性研 究，血浆 EBV⁃DNA 诊断早期 NPC 特异度及灵敏度 均良好。但与其他实验室的检测结果相比明显较高， 这或许是因为检测方法、检测对象及阈值的设定不 同。近五年关于早期NPC患者血浆EBV DNA研究 结果见表1。随后Chan等［15］ 还分析了NPC患者血浆 EBV DNA的大小，并强调了ctDNA大小是的一个重 要参数，对 ctDNA 分析（包括大小图谱）的深入了解 可能有助于其在癌症诊断中的全部潜力得以实现。 血浆 EBV DNA 目前广泛应用于 NPC 的筛查、 复发监测和预后。使用 qPCR 技术检测 BamHI⁃W 基因在研究学者看来能够获得更高的灵敏度。但 目前的研究存在一些不足：一、组织学亚型会影响 DNA 结果：EBV 感染多与高发地区的非角化型 NPC 相关 ，而角化型 NPC 大多检测不到 EBV 基因 组。二、单次血浆 EBV DNA 结果假阳性较高，需 要采集两次血样并进行内镜检查及影像学检查， 这会加重患者的心理负担。三、临床分期：对于较 早期的 NPC 即 EBV 再激活即复制早期，细胞周转 少，在凋亡/坏死过程中释放的 EBV DNA 不足以 在早期 NPC 患者的血浆中检测到，这会导致假阴 性结果的产生。综上所述血浆 EBV DNA 对于早 期 NPC 患者的筛查价值有限。

3 EBV 编码的 microRNA

EBV 是 首 个 发 现 可 以 编 码 miRNAs 的 病 毒。EBV miRNAs 可作为病毒致癌基因诱导宿 主细胞的基因突变和表观遗传改变，从而导致 NPC 发生和进展［21］。目前已鉴定出 25 个 EBV 相关的 miRNA 前体和 48 个 miRNA 成熟体，分 别由病毒基因组的两个区域 BamHI⁃A 右向转录 本（Bam HI ⁃A region rightward transcript，BART） 和 BHRF1（Bam HI fragment H right ward pen read⁃ ing frame 1）编码［22］。目前证明与 NPC 发生相 关 的 三 种 是 miR ⁃ BART7、miR ⁃ BART13 ⁃ 3p 和 miR⁃BART17。 miR⁃BART7 在未分化的 NPC 细胞中和组织 中高表达，具有潜在的诊断价值［23］ 。Wardana 等［24］ 在 138 例早期患者中使用定量 PCR 技术检测血浆 EBV miR⁃BART7 和 miR⁃BART13⁃3p 的表达，miR⁃ BART7 的 AUC 值 为 0.965，miR ⁃ BART13 ⁃ 3p 的 AUC 值 为 0.980，这 证 实 了 血 浆 miR ⁃ BART7 和 miR⁃BART13⁃3p 对早期 NPC 患者的具有较高准确 率。Gourzones 等［25］ 人发现在 NPC 患者血浆标本 中 miR⁃BART17 明显增加，且 miR⁃BART17 的显 著增加伴随着一个患者肿瘤质量的增加，敏感性 为 77%，特异性可达 90%。这提示血浆中 miR ⁃ BART17 的浓度可能与 NPC 的进展有关。与 EBV DNA 相比，血浆 EBV miRNAs 可能更直接地反映 了肿瘤的活性，这或许是因为 EBV⁃miR⁃BARTs 作 为病毒致癌基因在宿主细胞生存、免疫逃逸、细胞 增殖、细胞凋亡和肿瘤代谢中发挥关键作用，促进 NPC 的发生。但 EBV miRNAs 目前仅处于实验阶 段，并未进行大规模的验证，且检测质量影响因素 存在、缺少大型前瞻性研究证据，方法学有待标准 化等问题亟需解决。随着研究方法的改进，未来 EBV microRNAs 检测有望成为早期 NPC 潜在的分 子标志物。

4 联合检测

从 1970 年 开 始 ，研 究 者 们 使 用 EA ⁃ IgA 和 VCA⁃IgA 两项联合检测用于筛查中国南方 NPC 高 发地区的高危人群［8］。2008 年 Liu 共招募了 28 688 人参与了血清学筛查实验，总体 NPC 检出率 为 0.14%（41/28 688），随访第一年内早期诊断率为 68.3%（28/41），但阳性预测值只有 4.41%［26］ 。而 Li 等使用上述研究中的 46 份 NPC 血清以及 263 份 根据 EBNA1⁃IgA 和 VCA⁃IgA 结果被划分为高危 参与者的血清样本检测 EAD⁃IgA，称之为两步筛 选方案，使高危人群从 128 人降低为 27 人，阳性 预测值由 4.69%提高至 18.5%，仅遗漏一例极早期 病例［27］ 。两步筛选法提高了特异性，且不会显著 降低敏感性，使更多人避免了纤维内镜检查。目 前越来越多的学者建议将血清学抗体与血浆 DNA 联合检测在提高灵敏度和特异度的同时，将 阳性预测值提高，得到更好的诊断效能。综上所 述，使用 EBV 血清学抗体及血浆 DNA 联合检测， 或建立血清学的预测模型是鼻咽癌的早期筛查策 略之一，能够显著提高阳性预测值，减少不必要 的内镜或影像学检查，近五年联合检测结果比较 见表 2。 酶联免疫吸附法作为目前最常用的 EBV 血清 学检测方法，简便快捷且经济成本低，常用于 NPC 高发地区筛查及诊断。目前有专家提出将血清学 筛查与遗传学风险联合开发出了综合风险（com⁃ prehensive risk score，CRS）评分应用于鼻咽癌筛 查，阳性预测值从 4.70%（仅 VCA⁃/EBNA1⁃IgA）增加到 43.24%（CRS+VCA⁃/EBNA1⁃IgA），这为鼻咽 癌 的 早 期 诊 断 及 预 后 提 供 了 有 效 的 辨 别 模 式［28］ 。总之 EBV 血清抗体谱作为临床应用最广 泛的分子标志物，单一抗体多存在灵敏度或特异 度不足的缺陷，两种抗体联合检测多能满足临床 需求但对于鼻咽癌早期筛查存在阳性预测值低的 问题，而使用血清学检测与 CRS 相结合则能有效 提高阳性预测值，避免了大量非 NPC 患者免受内 镜及影像学检查的痛苦，是目前临床最高效的早 期筛查手段之一。

5 总结与展望

EBV 在鼻咽上皮建立异常的潜伏感染，在多 种因素的作用下裂解再激活诱导肿瘤微环境有助 于 NPC 的发展及维持，并因机体对肿瘤相关病毒 的黏膜抗体应答，使得多种 EBV 血清抗体、血浆 EBV ⁃ DNA 及 EBV 编码的 miRNAs 成为了早期 NPC 液体活检的分子诊断标志物及潜在分子标 志物。近年来随着高通量测序及液体活检技术的 广泛普及，越来越多的肿瘤循环 RNA（circulating tumor RNA，ctRNA），例如长链非编码 RNA 及环 状 RNA 在 NPC 早期筛查诊断中扮演了重要的角 色。相信随着研究方法的改进及大规模的验证， 越来越多的新型分子诊断标志物能够应用于早期 NPC 的筛查及诊断。

参考文献略。

来源：邢利,任明君,唐石伏.早期鼻咽癌外周血EB病毒相关分子诊断标志物研究进展[J].分子诊断与治疗杂志,2022,14(09):1455-1458+1463.

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