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近日，北京医院、国家老年医学中心内分泌科郭立新教授团队段晓晔博士针对慢性睡眠剥夺对骨骼的影响的研究，发表于期刊Nature and Science of Sleep上，下面让我们一起看看，这项研究都有哪些重要发现。
研究标题：慢性睡眠剥夺损害生长期大鼠的骨形成，并下调骨组织中PI3K/AKT信号通路
作者：段晓晔，潘琦，郭立新 北京医院 国家老年医学中心
睡眠不足在青少年中越来越普遍
既往一些临床横断面研究提示睡眠剥夺可能与骨骼健康存在相关性，当今社会睡眠问题在青少年中越来越普遍。青少年期正是生长发育的关键时期，睡眠剥夺对成长期骨骼发育以及对骨代谢的影响，尚缺乏相关研究探索。本研究的目的在于研究慢性睡眠剥夺（CSD，Chronic sleep deprivation）对成长期大鼠骨骼发育和骨代谢的影响，并初步探索其可能相关机制。
研究设计：20只5周龄Wistar雄鼠，经过1周适应性饲养后随机分为CSD组和正常对照组（normal control，NC）组。CSD组进行每日8：00-18：00进行连续10小时睡眠剥夺，连续干预时间6周时间，对照组饲养于相同环境但不进行任何干预。在干预0、2、4、6周时分别采集两组大鼠眼内眦静脉血，动态观察大鼠血清骨转换生物标志物（bone turnover markers, BTMs）水平变化，包括成骨指标I型胶原N端前肽（Procollagen type I N-terminal propeptide，P1NP）和破骨指标I型胶原C端肽交联（Carboxyl-terminal telopeptide of type 1 collagen，β-CTX）。6周后用过量麻醉药物处死大鼠，取双侧股骨标本，分别进行Micro-CT扫描、骨组织形态学观察、骨组织转录组学测序（RNA-seq）。采用SPSS 24.0软件进行数据统计分析。
睡眠不足影响大鼠骨骼生长
研究发现，CSD影响了生长期大鼠的骨骼生长发育，主要是抑制了骨形成过程。
①Micro-CT数据显示（图1），CSD组大鼠的骨微结构异常，骨小梁静态参数骨体积分数（Bone volume/tissue volume，BV/TV）和骨小梁数量（Trabecular number，Tb.N）显著降低（BV/TV: 0.267±0.009 vs 0.223±0.016，p=0.031; Tb.N: 3.514±0.124 vs 3.057±0.154，p=0.033）；骨小梁分离度（Trabecular separation，Th.Sp）和骨小梁结构模型指数（Structure Model Index，SMI）趋于增加，但未达到统计学差异（分别p=0.065，p=0.075）。
②血清标志物检测结果提示CSD干预6周后骨转换水平明显降低（P1NP: 442.4±70.9pg/ml vs 142.4±28.6pg/ml, p=0.002; β-CTX: 935.2±20.6pg/ml vs 706.1±43.5pg/ml, p＜0.001）；CSD可抑制血清骨形成标志物（P1NP）的水平，并在干预期间逐渐下降，最终与骨吸收标志物（β-CTX）失偶联，即使在调整了体重等混杂因素后，差异仍然显著（图2）。
③病理组织切片染色观察骨组织形态学分析提示，CSD组大鼠股骨干骺端生长板发育异常，软骨细胞增殖区细胞减少，软骨细胞肥大区增宽，软骨钙化区松质骨减少，骨小梁骨结构连续性差、排列紊乱、骨小梁空隙增大，成骨细胞减少，提示生长大鼠成骨减少，新骨形成和矿化受损（图3A-D，G）。
睡眠不足影响大鼠骨骼生长的机制探索
研究发现：CSD抑制了骨骼发育和成骨细胞分化相关的基因和蛋白表达，同时P13K/AKT信号通路明显下调。
①免疫组化分析，CSD组股骨组织中的成骨相关
②RNA-seq筛选出451个基因表达有显著差异（q-value < 0.1）：272个上调基因和179个下调基因；其中大部分下调基因集中在骨和软骨形成相关基因（图4C）。
③RT-qPCR的结果显示，与成骨相关的mRNA，如igf1、bglap、runx2、col1α1和pth1r的表达也呈不同倍数显著下调（图4E）。
④通过RNA-seq将DEGs进行富集分析，GO富集分析提示CSD组的成骨分化信号通路和骨骼发育信号通路明显下调，且GSEA的功能富集表明，这两种信号通路中的大部分基因在CSD大鼠中显著下调（图5）。
⑤KEGG功能富集分析发现一共有36条上调信号通路和18条下调信号通路具有统计学差异（FDR<0.05），将上调信号通路及下调信号通路前10个KEGG通路绘制成条形图，如图6所示。PI3K/AKT信号通路相关的显著下调，而氧化磷酸化和神经退行性疾病相关通路表达上调。
讨论及结论
一些横断面研究或者回顾性分析研究报道，
我们的研究发现慢性睡眠剥夺影响生长期大鼠的骨骼生长发育，特别是抑制了骨形成过程。Micro-CT数据显示，CSD组大鼠的骨微结构的改变，骨小梁静态参数BV/TV和Tb.N的显著降低；HE染色观察骨组织形态学分析提示，CSD组大鼠股骨干骺端生长板发育异常，软骨细胞增殖区细胞减少，软骨细胞肥大区增宽，软骨钙化区松质骨减少，骨小梁骨结构连续性差、排列紊乱、骨小梁空隙增大，成骨细胞减少，提示生长大鼠成骨减少，新骨形成和矿化受损。CSD可抑制血清骨形成标志物（P1NP）的水平，并在干预期间逐渐下降，最终与骨吸收标志物（β-CTX）失偶联，即使在调整了体重等混杂因素后，差异仍然显著；我们的结果提示CSD干预6周后骨转换水平明显降低。
既往研究报道，一些小样本队列研究显示，3周睡眠限制和同时出现昼夜节律紊乱的年轻男性中，P1NP水平仍然较低。睡眠限制和昼夜节律紊乱的受试者的骨转换状态不平衡，但结论尚未达成共识。Xu等的研究采用水平台法对成年大鼠每日连续18小时睡眠剥夺干预，持续3个月后，发现CSD大鼠的骨转换率降低。慢性睡眠剥夺3月后CSD组大鼠血清成骨指标P1NP和破骨指标I型胶原N端肽交联均显著降低，血清25（OH）D水平也低于对照组大鼠。但既往研究中长期睡眠剥夺的大鼠呈现渐进性加重的负能量平衡，虽然进食量可能增加，但体重却比对照组至少15%，这种高消耗的状态本身不利于骨形成。在本研究采用的睡眠剥夺方式较为温和且干预时间适当（每日10小时），尽管本研究中也观察到成长期CSD大鼠最终体重增加率低于对照组，但采用协方差分析，排除体重变化的混杂因素后，CSD组大鼠骨转换率仍然显著下降，体重改变对本实验结果的影响可以忽略。上述结果支持CSD组大鼠骨转换率下降，主要是骨形成受到抑制。
本研究提示CSD抑制了成骨细胞分化相关的基因和蛋白表达，从而损害骨骼形成和健康发育。IHC结果分析提示，CSD组股骨组织中的成骨相关蛋白Col1α1和OCN表达明显减少；RT-qPCR的结果还显示，与成骨相关的mRNA，如igf1、bglap（ocn）、runx2、col1α1和pth1r的表达也呈不同倍数显著下调；通过RNA-seq将DEGs进行富集分析，GO富集分析提示CSD组的osteoblast differentiation（成骨分化）信号通路和bone development（骨骼发育）信号通路明显下调，且GSEA的功能富集表明，这两种途径中的大部分基因在CSD大鼠中显著下调。
我们的研究发现，CSD动物模型中与成骨分化相关的转录因子的基因表达存在异常。Runx2是调控成骨细胞早期分化的关键转录因子，促进BMSCs向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化，调控下游成骨基因bglap（OCN）、col1α1。Runx2和 骨钙素（OCN）分别是成骨细胞分化早期和晚期的标志物。在成骨细胞分化的早期还分泌I型胶原，I型胶原是骨有机质中胶原的主要组成成分，参与构成矿物质沉积和结晶的支架。CSD可以通过抑制骨形成和成骨细胞分化，从而损害青少年的骨发育和生长，限制其达到最佳骨量峰值，可能未来加速与年龄相关的骨量下降。
本研究发现，CSD抑制了骨组织中的PI3K/AKT信号通路，PI3K和AKT的磷酸化水平下降，这可能部分解释了成骨分化和骨形成受损的原因。在KEGG富集分析中，我们观察到PI3K/AKT信号通路明显下调。既往研究证实，活化的PI3K/AKT信号促进BMSCs和前成骨细胞的成骨细胞分化，而靶向抑制PI3K/AKT信号通路减弱骨形成、诱导骨丢失。此外，PI3K信号通路在软骨细胞分化中发挥积极作用，并参与软骨内骨生长过程。Lin等研究发现，抑制PI3K/AKT信号通路也会导致软骨细胞肥大和软骨退行性变的衰减。这些研究的结果与我们的结论相一致。我们的数据进一步证实，在CSD大鼠模型中，骨形成和成骨分化受损可能与PI3K/AKT信号通路下调有关。
既往多项研究发现睡眠剥夺下调PI3K/AKT信号或抑制其磷酸化水平。AKT的磷酸化是PI3K/AKT通路的一个关键步骤，它参与了许多内分泌代谢活动，但在睡眠剥夺后磷酸化水平明显下调。在睡眠剥夺后4晚后皮下脂肪组织中的
以往大多数关注睡眠剥夺对骨代谢影响的研究大多数横断面研究或者回顾性研究，通过调查问卷、回忆评估睡眠剥夺状态并不准确，仅有的几项前瞻性研究中样本量仅5至20人，得到结论也尚不统一。这些研究的干预时间有限（≤3周），研究人员没有证实观察到的骨转换标记物的负性变化是否最终导致骨密度和骨质量的变化。并且大部分研究对象为成年人群，睡眠剥夺对成长期骨代谢影响关注不足，更缺乏相关分子机制的探讨。
本研究旨在探讨慢性睡眠剥夺对成长期大鼠骨代谢的影响及其可能的机制。我们的研究发现长期睡眠不足的青少年的骨骼生长和发育受损，主要表现在是成骨分化和骨形成受抑制，这可能与PI3K/AKT信号通路显著下调密切相关。睡眠不足可能是低骨密度、骨损伤和骨折的高危因素。青少年处于生长发育的关键时期，对睡眠障碍的评估应纳入学生的健康检查。未来应关注未成年人睡眠时间，及时改善睡眠情况，对于难以纠正的睡眠异常患者尽早使用抗骨质疏松药物治疗，避免骨质破坏、流失。
参考文献：
1. Swanson CM, Kohrt WM, Wolfe P, et al. Rapid suppression of bone formation marker in response to sleep restriction and circadian disruption in men. Osteoporosis Int. 2019;30(12):2485–2493.
2. Swanson CM, Shea SA, Wolfe P, et al. Bone turnover markers after sleep restriction and circadian disruption: a mechanism for sleep-related bone loss in humans. J Clin Endocrinol Metab. 2017;102(10):3722–3730.
3. Swanson CM, Shea SA, Kohrt WM, et al. Sleep restriction with circadian disruption negatively alter bone turnover markers in women. J Clin Endocrinol Metab. 2020;105(7):7.
4. Xu X, Wang L, Chen L, et al. Effects of chronic sleep deprivation on bone mass and bone metabolism in rats. J Orthop Surg Res. 2016;11(1):87.
5. Baker N, Sohn J, Tuan RS. Promotion of human mesenchymal stem cell osteogenesis by PI3-kinase/Akt signaling, and the influence of caveolin-1/ cholesterol homeostasis. Stem Cell Res Ther. 2015;6(1):238.
6. Lin C, Shao Y, Zeng C, et al. Blocking PI3K/AKT signaling inhibits bone sclerosis in subchondral bone and attenuates post-traumatic osteoarthritis. J Cell Physiol. 2018;233(8):6135–6147.
7. J. L. Broussard., et al. Impaired Insulin Signaling in Human Adipocytes After Experimental Sleep Restriction[J]. Ann. Intern. Med., 2012;157(8), 549.
8. Y. Li., et al. Autophagy Triggered by Oxidative Stress Appears to Be Mediated by the AKT/mTOR Signaling Pathway in the Liver of Sleep-Deprived Rats[J]. Oxid. Med. Cell. Longev., 2020, 1-11.
9. Chen H, Zhao Z, Zheng J, et al. The effect of IGF-1 on symptoms of sleep deprivation in a rat model of inflammatory heart disease and metabolic syndrome. Biochem Bioph Res Co. 2014;446(4):843–849.
10. Cao Y, Li Q, Yang Y, et al. Cardioprotective effect of stem-leaf saponins from panax notoginseng on mice with sleep derivation by inhibiting abnormal autophagy through PI3K/Akt/mTOR pathway. Front Cardiovasc Med. 2021;8:694219.
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