作者：李亚楠，韩光红，吉林大学口腔医院老年口腔科

牙髓作为牙齿内部的唯一软组织，在疾病防御、营养供给和修复再生等方面发挥着关键作用。然而，随着龋病的进展，牙髓组织容易因细菌侵入而引发牙髓炎，最终导致牙髓坏死。即使经过常规根管治疗，患牙也会因牙髓组织的丧失而增加变脆折裂风险。因此，保存或再生功能性牙髓对于维持牙齿的结构与功能至关重要。

干细胞治疗已成为牙髓再生领域中有前景的治疗选择，利用间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)强大的增殖分化潜能促进组织的修复与再生。然而，细胞治疗主要依赖于MSC的旁分泌作用，而不是该细胞在受损组织中的定植和分化。同时，潜在致瘤性、免疫排斥和伦理限制等缺点限制了其临床应用潜力。

细胞外囊泡(extracellular vesicles， EVs)作为MSC旁分泌效应的重要组成部分，在组织再生中发挥着与干细胞相似的作用，同时具有低免疫原性，易于生产、处理和储存等优势。由于独特的口腔组织来源，牙源性干细胞来源细胞外囊泡(dental stemcell derived EVs， DSC-EVs) 的促牙源性分化(odontogenic differentiation)功能明显优于其他间充质干细胞群。

目前，DSC-EVs凭借其优异的促成牙分化、免疫调节、神经保护及促组织再生功能，在牙髓再生领域展现出较好的应用前景。本文将从牙源性分化、血管生成、神经保护和免疫调节四个方面对DSC-EVs在牙髓再生领域的应用现状及其在牙髓再生医学中的潜在分子机制作一综述，为治疗牙髓疾病提供了新思路和新型微创治疗策略。

1.细胞外囊泡简介

EVs是由各种细胞产生的纳米到微米级颗粒，包括外泌体、微泡和凋亡小体。广泛存在于各种体液，且内部携带有蛋白质、脂质、DNA和RNA等生物分子。其中，外泌体主要由内涵体途径生成，常参与细胞间的通讯，能够传递生物分子并调节靶细胞的功能。微泡由细胞膜直接出芽形成，常在细胞应激或激活条件下释放，涉及炎症反应和细胞修复。

凋亡小体主要在细胞凋亡时形成，包含凋亡细胞的碎片和相关信号分子，有助于清除死亡细胞和调节免疫反应。EVs通过携带蛋白质、RNA和脂质与受体细胞相互作用，调节其功能，在免疫调节、神经信号传递和肿瘤微环境研究中具有重要意义，并广泛应用于炎症性疾病、癌症和器官移植等领域。临床中，EVs因其良好的生物相容性和低免疫原性，成为药物传递系统的研究热点，在肿瘤、心血管和神经退行性疾病中展现潜力。

此外，EVs反映亲本细胞的功能和不同病理条件下机体的代谢状态，可用于疾病早期诊断和监测，具有潜在临床诊断和治疗价值。牙源性干细胞(dental stem cell，DSC)是一类从口腔组织分离出的干细胞群体，主要包括牙髓干细胞(dental pulp stem cell，DPSC)、脱落乳牙干细胞(stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED)、根尖乳头干细胞(stem cell from apicalpapilla，SCAP)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell，PDLSC)及人牙龈来源的间充质干细胞（GMSC）等。

作为一类口腔组织干细胞群体，DSC在牙髓再生医学方面比其他MSC样细胞群更具优势，包括：易于获取，对人体侵入性小、更强的生长和自我更新能力、更高的分化能力和增殖率、具有多能性、免疫调节作用和独特的神经保护功能。DSC在促成牙分化方面优于其他MSC，可能与口腔环境的复杂性和特殊的组织来源有关。

其中，DPSC起源于神经系统，可以分化成胶质细胞和神经元，具有分泌神经营养因子的能力，在促进神经突起生长和神经保护中发挥作用。此外，DPSC具有强大的血管生成能力，在特定环境条件下通过分泌血管生成调节因子生成类似毛细血管的结构。因此，DPSC凭借出色的神经分化能力和强大的血管生成潜力，成为牙髓再生的最佳细胞来源。

近年来，DSC-EVs凭借低免疫原性、良好的生物相容性、高载药能力、高稳定性和有效的细胞间通讯，成为牙科领域的研究热点。为了更好地应用DSC-EVs于牙髓再生，准确、高效地提取和鉴定DSC-EVs至关重要。EVs含有丰富蛋白质，可作为表面标志物用于囊泡分离与鉴定。常用的EVs提取方法包括差速超速离心、密度梯度离心、免疫捕获法和超滤法等。

其中，差速超速离心在DSC-EVs提取中的应用可获得高纯度、高浓度的EVs，保证其在牙髓再生中的有效性。2018年，国际细胞外囊泡协会指出差速超速离心仍是EVs分离最常用方法。此外，密度梯度离心可进一步提高EVs的纯度，免疫捕获法则可利用表面标志物进行特异性提取，均为牙髓再生提供更加精准和高效的治疗手段。

2.DSC-EVs 在牙髓再生领域的应用

牙髓血运重建是目前相对成熟且应用于临床的一种牙髓再生疗法。但该技术仅限于根尖开放的年轻患者，易发生血源性牙齿变色，且无法再生功能性牙髓。由于髓腔周围矿化的牙本质壁和微小的根尖通路，干细胞移植往往因空间限制和供血不足发生细胞凋亡。此外，天然组织培养的细胞外培养基可分离出各种生物活性因子，通过激活干细胞以启动再生或者修复程序。然而，生长因子是细胞分泌的可溶性蛋白质，其有效半衰期短、稳定性差及在生理条件下快速被酶失活的特性，明显降低治疗效率。因此，基于EVs的无细胞治疗引发研究者热切关注。

1）牙髓组织再生：牙髓作为牙齿内部唯一的软组织，在其修复再生、营养供给和疾病防御等方面起着重要的主导作用。近年来，组织工程技术和生物材料科学的最新研究加速了牙髓再生学的发展，导致根管治疗的范式转变。

Zhang等开发一种增强血管生成的可注射根充糊剂，通过DPSC来源细胞外囊泡(DPSC derived EVs，DPSC-EVs)联合纤维蛋白凝胶，形成囊泡原位递送平台。体外结果发现7天内实现快速血管化，包括胶原基质沉积增加和促血管生长因子的持续释放，提示DPSC-EVs再生血管化牙髓组织的潜力。纤维蛋白凝胶是由活化凝血酶催化纤维蛋白原而形成，介导内皮细胞扩散、成纤维细胞增殖及毛细血管形成。改变纤维蛋白原浓度可调节纤维蛋白的密度、直径和孔径，实现凝胶微观结构的精确调控，以改善组织因子传递。

此外，Chen等将脂多糖预处理的DPSC-sEVs联合水凝胶植入大鼠无牙髓根管中，实现牙髓组织再生，指出炎症状态下的EVs可能表现出更强的组织再生潜能。Wang等开发了一种可注射热敏水凝胶，通过将人类DPSC 来源外泌体(DPSC derived exosomes，DPSC-Exos)联合羟丙基壳聚糖/壳聚糖晶须，形成外泌体负载的水凝胶。体外实验显示，该水凝胶显著促进了牙本质和血管生成。

在体内实验中，植入牙根模型8周后形成了新生牙髓样组织，表明该水凝胶在牙髓再生方面具有替代传统根管治疗的潜力。近年来，研究发现生物支架可通过提供牙源性分化相关微环境促进内源性干细胞的牙源性分化。Guo 等利用天然支架脱细胞牙基质(decellularized tooth matrix， DTM)和人DPSC 聚集物模拟牙髓发生相关的发育微环境，在临床试验和动物模型中实现三维牙髓牙周组织再生，并恢复温度等感觉刺激。同样Diomede等发现脱细胞牙髓基质支架联合DPSC-EVs诱导DPSC牙源性标志物高表达，实现体外牙髓组织再生。

2）牙本质再生：牙本质形成作为一种防御反应在牙髓治疗中具有重要意义。未经治疗的龋齿会进一步侵犯牙髓，需要氢氧化钙等材料覆盖暴露牙髓，以消除感染、控制炎症、保存牙髓活力、促进修复性牙本质桥的形成。然而，牙科材料不能催化组织新生或提供完整的牙髓防御。

目前为止，已有各种生物支架用于促进牙本质再生。Swanson等将DPSC来源外泌体(DPSC derived exosomes，DPSCExos)与可降解聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架结合，设计出一种可注射给药的新型盖髓剂，与水接触后持续有效地释放外泌体。为评估新型盖髓剂体内诱导修复性牙本质形成的能力，研究者将Exos负载材料植入雄性大鼠上颌磨牙活髓切断模型中。

6周后组织学分析发现，与单独使用玻璃离子聚合物相比，新型盖髓剂组在牙髓-牙本质界面形成典型的牙本质小管，高度矿化的组织和更完整的牙本质桥，Masson三色染色显示出丰富的胶原基质沉积，实现了以仿生方式刺激修复性牙本质再生。

Zhuang等将SCAP 来源外泌体(SCAP derived exosomes，SCAP-Exos)联合水凝胶植入根管，并皮下移植到免疫缺陷小鼠背部12 周。组织学分析显示SCAPExos组形成新生连续牙本质层，成牙本质细胞数量明显增加。

处理过的牙本质基质(treated dentine matrix，TDM)是具有生物活性的细胞外基质，含各种牙本质再生所需活性分子，可作为牙齿再生的天然支架材料。Wen等发现DPSC来源细胞外小囊泡(DPSC derived sEVs，DPSC-sEVs)联合TDM 能够有效招募牙髓细胞，刺激反应性牙本质再生。与三氧化矿物凝聚体相比，EVs-TDM具有更优秀的牙源性诱导能力。

最近，Lu 等将SHED 来源EVs(SHED derived EVs，SHED-EVs)与光交联明胶甲基丙烯酰水凝胶结合，设计出一种可注射水凝胶，用于促进牙本质再生。体外实验显示，SHED-EVs通过激活AMPK/mTOR通路促进了DPSC的增殖和迁移。为验证体内疗效，研究人员将其植入裸鼠的牙根片模型中。结果显示，8周后该水凝胶促进了牙本质生成，增加了矿化组织，并提升了牙本质涎磷蛋白（DSPP）和牙本质基质蛋白-1的水平。以上研究证实了DSC-EVs在体外和体内具有促进牙本质样结构再生的能力。

3.DSC-EVs在牙髓再生中的潜在分子机制

1）牙源性分化：高质量修复性牙本质桥形成是体外刺激牙髓损伤后牙髓再生成功的关键因素。牙源性EVs通过促进内源性干细胞的迁移、增殖和牙源性分化，具有良好的牙本质发育和修复能力。Hu 等通过研究DPSC-Exos 的MicroRNAs 表达谱发现，外泌体miR-27a-5p通过下调抑制分子LTBP1激活TGFβ1/SMAD 信号，诱导DPSC 牙源性分化。

值得注意的是，在牙源性条件下，即在含有牙源性诱导因子的培养基中培养DPSC所分离得到的DPSCExos，对DPSC的牙源性分化具有更强的诱导作用。

同时，Huang等研究发现，成牙分化诱导条件下牙髓细胞来源的外泌体可以触发更显著的牙源性标志基因的表达，如Runt相关转录因子2（RUNX2）、碱性磷酸酶、骨桥蛋白、胶原蛋白1、DSPP，更好地促进了DPSC和骨髓间充质干细胞的成牙分化。当外泌体与DPSC共同孵育后，在体内牙齿切片上促进了牙髓样组织再生。

此外，Zheng等发现DPSC-EVs中miR-125a-3p通过直接靶向IKBKB 抑制NF 和TLR通路，将巨噬细胞转变为促进组织愈合的M2表型。M2 型巨噬细胞通过释放骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP2)激活BMP2信号通路，促进DPSC牙源性分化。最近，Yan等发现炎症微环境下的DPSC-EVs 通过miR-758-5p/LMBR1/BMP2/4轴增强牙源性基因和蛋白的产生，进而调控PDLSC的牙源性分化。

2）血管再生：血运重建是牙髓再生的先决条件，为组织存活提供足够的氧气和营养。牙源性EVs 参与组织血管生成的各种重要分子途径包括TGF-β/SMAD2/3信号通路、Hedgehog/Gli1信号通路、Cdc42 信号通路和VEGF 信号通路。其中，SCAP-Exos 通过Cdc42信号通路促进细胞骨架重组，激活组织血运重建。SHED 聚集物来源外泌体通过传递miR-26a 激活TGF-β/SMAD2/3 信号通路，促进牙髓组织血管生成。

最近，Li等发现人DPSC来源凋亡小体通过传递线粒体翻译延伸因子Tu以激活内皮细胞自噬信号，促进血管生成，结果提示牙髓再生与供体细胞凋亡在一定程度上存在有益关系。此外，Zhou 等发现牙周炎受损DPSC来源EVs内部miRNA-378a通过靶向Sufu基因激活Hedgehog/Gli1信号通路，促进局部血管生成。该研究提示因不可逆牙髓炎或牙周炎而被丢弃的牙齿可能是再生治疗和研究的理想细胞来源。

3）神经保护：牙源性干细胞源自颅神经嵴细胞，表现出较好的神经支持和神经保护特性。Venugopal等指出，DPSC-Exos表现出对抗红藻氨酸诱导的兴奋毒性的神经保护潜力。此外，DPSCExos通过降低IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子的表达缓解小鼠的神经损伤、脑梗死和脑水肿，其神经保护机制与抑制HMGB1/TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路相关。以上研究均表明DSC-EVs 具有促进神经修复再生的潜能。

Guo等在临床试验中发现人DPSC聚集物联合DTM能够再生出具有神经且受温度等感觉刺激的牙髓组织，并指出DPSC在此微环境中产生的外泌体数量明显增加。然而，该牙源性外泌体参与神经保护的分子机制尚不清楚，需进一步探索。

Jarmalaviĉiūté等研究发现，SHED来源的外泌体能够对6-羟基多巴胺诱导的人多巴胺能神经元凋亡起到抑制作用，在氧化应激期间的抗凋亡率约80%，也被认为是治疗帕金森病的新的潜在治疗工具。

4）免疫调节：牙髓炎初期，炎性介质是组织修复的关键驱动因素，但细胞因子的持续存在会导致牙髓坏死。细胞因子是重要的调节因子，通过复杂的网络调节炎症反应，并作为许多疾病的生物标志物。Li等发现DPSC-Exos可以通过减弱关键炎症细胞因子的表达来延缓脑缺血再灌注损伤诱导的神经炎症，这些细胞因子涉及HMGB1、TLR4、TNF-α、NF-κB、IL-6 以及IL-1β，与抑制HMGB1/TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

与骨髓间充质干细胞来源Exo相比，DPSC-Exos 在调节不同淋巴细胞亚群的分化、细胞因子的促炎和抑炎作用、细胞凋亡和增殖方面表现出更多潜力。同样，SCAP-Exo可以通过降低炎症相关因子NF-κβ和IL-1β的表达来阻止顺铂诱导的急性肾损伤中的促炎作用。巨噬细胞在炎症环境及组织再生调控中扮演着重要的角色。

Liu 等发现DPSC-Exos 通过激活ROSMAPK-NFκB P65信号通路抑制M1巨噬细胞极化，减轻细胞炎症反应以修复脊髓损伤。最近，Zheng等发现DPSC-EVs具有牙源性免疫调节特性，EVs内miR-125a-3p通过直接靶向IKBKB来抑制NF和TLR通路，将巨噬细胞转变为促愈合的M2表型，实现牙髓组织的修复和再生。

综上所述，DSC-EVs通过多种分子机制促进牙髓再生，包括牙源性分化、血管再生、神经保护和免疫调节。未来研究应系统探讨EVs内关键分子的具体功能，探索其与其他再生材料和药物的联合应用，并评估其长期效果和安全性。

来源：李亚楠,韩光红.牙源性干细胞来源细胞外囊泡在牙髓再生中的研究进展[J].现代口腔医学杂志,2025,39(04):340-344.