作者：郭宏涛，周如丽，朱万春，川北医学院附属医院口腔科

继发龋是指现有修复体边缘的病变或与修复体、粘接剂相关的龋齿，与其他龋病遵循相同的发病机制，即牙齿硬组织脱矿和胶原纤维降解，是临床牙体直接充填修复失败的主要原因。继发龋的形成是一个复杂的多因素过程，主要因素是修复体与牙体硬组织之间的微渗漏或纳米渗漏导致细菌生物膜及其酸性产物进入粘接界面，从而破坏修复体与牙齿之间的结构完整性。

牙齿复合树脂修复体周围龋病形成模型的研究表明，消除或减少继发龋发生的关键在于保持牙齿与修复材料之间的密闭性和结构完整性。牙本质由于结构及组成的特殊性，相比牙釉质而言，其粘接界面更容易发生微渗漏。诱导并促进混合层中暴露的牙本质胶原纤维再矿化，可有效提高牙本质与复合树脂粘接界面的稳定性和耐久性。

牙本质基质蛋白（dentin matrix proteins，DMP）和牙本质唾液磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）等天然非胶原蛋白（non-collagenous poteins，NCPs）能够促进牙本质再矿化，并诱导矿物质沉积。但天然或重组NCPs来源有限，体外提取和纯化过程复杂，获取难度较大。学者们致力于寻找NCPs类似物，以期模拟天然蛋白质的功能。人工合成多肽因较天然多肽更具经济性和可控性而受到广泛关注。本文主要就人工合成多肽促牙本质再矿化预防继发龋的研究进展做一综述。

1. 牙本质再矿化机制

早期牙本质再矿化研究采用了经典的离子基结晶理论；根据这一理论，牙本质再矿化过程依赖于脱矿胶原基质内剩余磷灰石晶体的外延生长。由于胶原纤维难以诱导钙磷离子结晶成核并沉积，牙本质再矿化过程需要高浓度的钙磷离子渗透到胶原基质中。如果胶原纤维基质中没有或仅有少量的磷灰石晶体，则不会发生再矿化。然而，酸蚀后的牙本质或龋坏更深部分所暴露的有机基质中缺乏残留的矿物晶体和磷灰石种子晶体。

这一现象表明，离子结晶理论可能不适用于混合层中完全脱矿的牙本质再矿化。此外，有研究显示，即使使用高浓度钙磷溶液进行长时间的再矿化处理，也仅能在脱矿牙本质表面观察到高度矿化的结构，而无法实现深处牙本质胶原蛋白矿化。传统“自上而下”的牙本质再矿化方法在牙本质胶原纤维间及纤维内难以取得满意的效果。

随着对牙本质结构及再矿化机制研究的不断深入，学者们发现牙本质基质中富含多种酸性氨基酸结构NCPs，其在牙本质矿化过程中发挥着至关重要的作用。一方面，NCPs中的羧酸和磷酸官能团具有促进钙离子和磷离子成核的能力，同时还可作为磷灰石的优先结晶位点。这一特性使其能够作为模板，螯合大量钙磷离子，形成无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate，ACP），并进一步诱导ACP向羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAp）转化。这种转化过程有助于调节离子饱和度与矿物沉淀之间的平衡。

另一方面，ACP本身具有不稳定性，故牙本质再矿化过程中最初形成的ACP需要NCPs的稳定作用，以保持其在纳米相中固存。随后，这些稳定的ACP会被定向输送到胶原基质的间隙区域，转化为结晶磷灰石，从而完成牙本质的纤维内矿化。这种“自下而上”的牙本质仿生再矿化方法，除可显著提高脱矿区牙本质生物力学性能和机械性能外，还可通过抑制胶原纤维内的内源性基质金属蛋白酶和半胱氨酸组织蛋白酶活性，来有效延长树脂-牙本质键的寿命，在长期保护混合层和预防继发龋的发生上展现出广阔的应用前景。

2. 人工合成多肽在促牙本质再矿化预防继发龋中的作用

许多研究提出并验证了天然NCPs的矿化功能主要来源于一些具有矿化能力的多肽片段。受此启发，Wang 等合成了一个多肽片段（EEEEEEDSpESpEEDR），并在体外证明这种含有特殊序列的合成肽能够有效诱导和促进胶原纤维表面及微纤维间隙区域矿化。随后有研究发现，2个或更多个天然蛋白功能结构域连接在一起设计合成的多肽，可获得其相应功能。当HAp特异性肽与其他特性的肽（如抗菌肽和胶原亲和肽）进行偶联时，可进一步封闭牙本质小管，促进牙本质再矿化，并修复受损的粘接剂-牙本质界面，从而取得良好的预防继发龋效果。

目前，寻找与矿物质有特定亲和力的多肽或其他功能成分，并将其与其他特性的肽相结合，以促进牙本质再矿化，保护和提高牙本质粘接界面的完整性和稳定性，进而降低继发龋发生，已成为近年来的研究热点。

2. 1 矿物-胶原双亲和肽

口腔内唾液持续流动形成的液体环境易导致治疗药物流失，仅依靠再矿化肽序列较难达到理想的牙本质再矿化效果；赋予其胶原结合能力，有助于延长再矿化多肽在牙本质中的停留时间，增强牙本质再矿化效果。NH2-CQDSETRTFYDSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY-COOH（CYP）是含有胶原结合序列和再矿化序列的新型合成肽。其中，CQDSETRTFY作为胶原结合序列，在治疗年龄相关性黄斑变性研究中被验证为胶原表面锚定分子。双缩脲反应法、共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）和原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）的观察结果也证明，CYP能牢固附着在脱矿牙本质胶原纤维上，并展现出一定抗冲洗能力。

DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY与钙离子和HAp的高亲和力，赋予了CYP再矿化特性。Li 等通过扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）和透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）发现，CYP可作为成核模板，吸引钙磷离子在Ⅰ型胶原纤维上沉积，并形成针状矿物晶体；其在经CYP处理14 d的脱矿牙本质小管及表面观察到了大量的再生矿物颗粒，且钙磷离子的含量显著高于未经CYP处理的脱矿组和对照组，成功实现了纤维间和纤维内矿化。

此外，CYP增强了脱矿牙本质的显微硬度，有效改善了其生物力学性能；这有助于保护牙本质粘接界面，减少继发龋的发生，并提高修复体寿命。大鼠龋病模型的MicroCT 分析和Keyes评分结果均显示，CYP在生物膜环境中同样能够取得理想的再矿化效果。DMP1是一种天然NCPs，其序列DSESSEEDR已被证明与胶原纤维具有较高的结合亲和力。Statherin蛋白在口腔中作为钙磷离子的抑制剂，拥有吸附HAp 的能力；由其衍生的DpSpSEEKFLRRIGRFG序列在控制HAp生长中起到重要作用，能够通过静电相互作用和构象变化吸附到HAp表面。

Fan等将DSESSEEDR为N端、Dp‑SpSEEKFLRRIGRFG 为C 端，合成一种新多肽DSESSEEDRDpSpSEEKFLRRIGRFG（DGP）。无论是体外人工唾液环境下，还是大鼠龋病模型这一更为仿生的环境下，DGP均能诱导HAp晶体在胶原纤维内外有序沉积。

2. 2 矿化-抗菌双功能肽

正常情况下，唾液缓冲系统可调节再矿化与脱矿之间的平衡。但口腔中的致龋菌通过糖的分解代谢产生酸，打破了这种平衡，导致矿物质脱矿，进而造成龋齿的发生和发展。因此，控制细菌生物膜的形成是预防继发龋发生的关键因素。抗菌肽是一种活性物质，能够直接与微生物表面结合；当其穿透细胞膜后，与细胞内物质相互作用，抑制细胞内酶活性，破坏核酸、蛋白质和细胞壁合成，可在表达广谱抗菌性的同时不产生广泛耐药性。

已有研究表明，天然抗菌肽可杀灭口腔致龋菌。然而，天然抗菌肽性质不稳定，会受到口腔环境影响而削弱抗菌效果。研发具有高活性和理想稳定性的人工抗菌肽，并将其与具备矿化特性的功能域结合，可有效防治继发龋。PolyphemusinⅠ蛋白来源于马蹄蟹，是一种有效抑制变形链球菌生长和牙菌斑生物膜形成的广谱抗菌肽，体外实验表明其最低的抑菌浓度为40 μg/mL，具有良好抗菌活性。没食子酸（gallicacid，GA）可诱导和加速矿物质矿化；Zhang等将其作为再矿化结构域并连接到PolyphemusinⅠ上，从而合成一种拥有矿化和抗菌双功能的新型肽GAPI；CLSM 和SEM 图像显示，GAPI 可破坏变形链球菌结构，并降低其生物膜的数量和活性，且GAPI 组牙本质小管和小管间矿物质丰富，牙本质表面仅有少量牙本质胶原纤维暴露。

在不同种类的哺乳动物中，已经鉴定出抗菌肽的导管素衍生肽（cathelicidin）家族；而在人类中，仅发现了L1LGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES37（LL-37）。Wang利用合成肽技术，成功发现了与LL-37残基18-19对应的最小抗菌肽KR-12；且在小鼠脓毒血症模型治疗的研究中，肯定了KR-12在体内的广谱抗菌性。

随后的体外研究证明了KR-12对口腔致龋菌具有显著的抗菌和抗生物膜活性。受到KR-12的启发，Niu 等将GA 作为官能团与抗菌肽结合，使用Fmoc合成法成功合成了一种双功能肽GA-KR12；其将640 μmol/L 的GA-KR12 应用于人造牙本质龋齿中并进行变形链球菌膜-再矿化循环，通过SEM观察到牙本质表面相对光滑，胶原纤维少量暴露，同时GA-KR12破坏了变形链球菌的细胞质膜和细胞壁结构，抑制了变形链球菌生物膜在牙本质表面的生长；此外，经GA-KR12处理的脱矿牙本质的龋坏深度、矿物质损失及酰胺Ⅰ带与HPO42-比值均明显低于对照组。这些结果表明，GA-KR12有效促进了纤维外矿物质形成及脱矿牙本质再矿化，减少了牙本质胶原纤维降解。

总体而言，矿化-抗菌双功能肽通过抑制变形链球菌生物膜的生长使细菌产生的酸性代谢产物显著降低，有效抑制了胶原纤维支架的降解及牙本质矿物晶体的酸性溶解，为龋坏牙本质创造了良好的再矿化环境。在此基础上，矿化功能域吸引并结合环境中的钙磷离子，进一步促进牙本质再矿化，从而降低了继发龋的发生和病变程度。矿化-抗菌双功能肽的应用和研究前景广阔，未来应更加关注延长药物的作用时间，以提供长期而稳定的再矿化环境。

2. 3 釉原蛋白肽衍生物

釉原蛋白氨基酸序列可分为富含酪氨酸的N端结构域、中央富含脯氨酸的区域、聚脯氨酸三肽重复区域和亲水的C端结构域。研究发现，N端结构域可自组装成沿胶原纤维长轴定向的细长链或细丝状结构；亲水的C端结构富含一系列带负电的酸性残基，可为磷酸钙提供成核位点，诱导晶体定向生长；中央主要由谷氨酰胺（Q）-脯氨酸（P）-X重复基序组成的区域可能与控制晶体间距有关。

基于以上研究，Lv 等将5 个Q-P-X 重复序列（QPY-QPVQPH-QPM-QPQ）与釉原蛋白的C 端（TKREEVD）结合，设计了釉原蛋白衍生物，并命名为QP5；其发现QP5 可促进牙釉质龋齿再矿化。有研究发现，QP5可上调矿化相关基因的mRNA 和蛋白质表达，促进三期牙本质形成。基于QP5的牙本质再矿化潜力，同时考虑到口腔复杂环境对药物浓度的影响，有研究首次将拥有优秀生物特性和载药能力的N，N，N-三甲基壳聚糖（N，N，N-trimethylchitosan，TMC）作为QP5载体，合成了一种新型药物TMC-QP5纳米颗粒，将其应用于牙本质再矿化过程，并评估其预防继发龋的能力；TEM图像和表面硬度恢复百分比的分析结果显示，TMCQP5组和QP5组在牙本质小管纵切面上均可见到被大量矿物包裹的增厚的胶原纤维，脱矿牙本质表面力学性能得到显著改善。

此外，当TMC与QP5的质量比为4∶1时，包封效率和载药量达到最大值［ 分别为（69.63 ± 2.22）% 和（13.21 ±0.73）%］；且QP5在前4 h爆发性释放，4 ~ 12 h逐渐缓慢释放，最终持续释放36 h；研究者认为，TMC-QP5中的QP5持续缓慢释放，并在牙本质小管中长时间保持有效浓度是其再矿化效果和牙本质-树脂界面密封性能优于QP5的主要原因。

Gungormus等确定了釉原蛋白中HAp结合肽的共享区域；这个由22个氨基酸组成的长肽区域被称为釉原蛋白衍生肽5（amelogenin-derived peptide 5，ADP5），能够在脱矿的根部牙本质上形成磷灰石矿物层。有研究在保持促进HAp结合和矿化的ADP5带电氨基酸片段完整的同时，消除了氨基和羧基端的疏水结构域，获得了更短且水溶性更强的肽（sADP5）。

脱矿的牙本质经过sADP5引导的3轮矿化形成了连续的新矿物层，并向牙本质小管内延伸；其形成的锥形结构，使暴露的牙本质小管完全闭塞。由于肽引导的矿化处理，新形成的矿物在牙本质中形成了结构性的相互渗透。矿物层的平均硬度和弹性模量值明显高于脱矿和健康的人牙本质，但低于健康的牙釉质。纳米压痕和热老化法的结果也证明，在sADP5引导下形成的连续、坚固且稳定的矿物层-牙本质界面有利于保持树脂-牙本质界面的完整性，并减少继发龋的发生。

研究还发现，与无肽情况相比，sADP5存在时矿化反应速率提高了约2.5倍，37 ℃下90 min消耗了一半以上的可用游离钙，一定程度上符合预粘接快速的牙本质内矿化策略，为临床快速改善牙本质理化特性并提高牙本质的粘接强度和粘接耐久性提供了新思路。

2. 4 牙骨质蛋白衍生肽

牙骨质蛋白CEMP1仅在牙骨质中表达，其可在牙骨质形成过程中调节HAp形成。体外实验表明，当CEMP1在靶向部位积累时，可有序引导HAp。通过TEM和AFM观察发现，由CEMP1 N 端末尾区域20 个氨基酸（MGTSSTDSQQAGHRRCSTSN）组成的CEMP1 衍生肽CEMP1-p1可调节HAp晶体形成，并以某种方式模拟矿化组织的生物形成过程。

受此启发，Wang 等设计了由CEMP1 生物活性肽序列［NNCCCCRRES（p）］和疏水尾部（C16H31COOH）组成的仿生寡肽；其发现，引入钙离子时，仿生寡肽会自组装成超分子纳米基质，并将生物活性肽暴露在纳米基质表面。寡肽纳米基质凭借对脱矿牙本质的强结合和抗水冲洗能力，可作为模板在脱矿牙本质上诱导矿化并重建硬组织，从而实现显著的纤维内矿化和封闭牙本质小管效果。

因此，CEMP1仿生寡肽在治疗牙本质敏感和继发龋方面具有巨大的应用潜力。尽管越来越多的研究表明，CEMP1衍生肽在体外具有诱导HAp晶体成核和生长的能力，但其矿化机制仍不明确，相关研究也较为有限；学者们在不同层面上进行了探索。Campos等利用圆二色光谱和核磁共振确定了CEMP1-p1 的三维结构，并从结构数据上提出其对HAp的亲和力来源于侧链（Asp-7、Gln-10、Arg-14、Ser-19）与HAp表面成分形成的静电作用，而最初与HAp表面相互作用无关的丝氨酸残基可能参与对钙离子的吸引。

另一项研究发现，CEMP1的C端衍生合成肽（CEMP1-p4）可激活人口腔黏膜干细胞中的Wnt/β-Catenin信号通路，诱导其分化为矿化样表型，形成矿化钙结节；这可能对骨、牙骨质和牙本质等矿化组织的修复和再生具有潜在治疗意义。

3. 结语

近年来，人工合成肽在体内外研究中展现了优异的性能，尤其是在促牙本质再矿化和保护胶原纤维方面，可有效修复脱矿牙本质，并显著改善其生物力学性能，在预防继发龋方面具有巨大潜力。然而，口腔生态系统和临床修复过程的复杂性远超实验模型，涉及多种生物膜、微生物群落、唾液、液体的连续流动、pH值、温度及唾液和血液对粘接界面的污染等诸多因素。

未来应重点研究合成肽在不同或多重因素影响下重建牙齿硬组织的能力。在合成肽的应用中，还需关注有效浓度迅速下降的问题，以及如何在作用位点上保持较长时间的活性；寻找合适的载体以控制多肽释放尤为重要。此外，近年来纳米材料在生物医学领域的应用日益广泛，尤其在给药领域取得了显著进展，开发纳米材料作为肽类药物的载体具有重要价值。

来源：郭宏涛,周如丽,朱万春.人工合成多肽促牙本质再矿化预防继发龋的研究进展[J].中国实用口腔科杂志,2025,18(03):358-363+371.DOI:10.19538/j.kq.2025.03.016.