肠道纤维化是克罗恩病 (CD) 和溃疡性结肠炎 (UC) 面临的重大临床难题，其主要由人肠道肌成纤维细胞 (HIMF) 过度沉积细胞外基质 (ECM) 引起，且一旦形成便可独立于炎症持续进展，导致传统抗炎药物对狭窄型CD疗效甚微。既往蛋白质组学研究发现，在CD患者的HIMF衍生的ECM中，转谷氨酰胺酶2 (TG2) 存在特异性上调。尽管细胞外TG2具有激活TGF-β1、交联ECM蛋白以及促进细胞增殖和存活等多种促纤维化功能，并在肾、肺、肝等器官纤维化中得到验证，但其在肠道纤维化中的作用尚属未知。

该研究综合采用了人体组织标本分析、体外细胞实验、多组学测序及动物模型验证等多种方法。首先，获取狭窄型与非狭窄型CD、UC及正常对照的全层肠道组织标本，经组织病理学评分后，通过原位生物素化尸胺掺入法检测TG活性，并利用免疫荧光共定位明确TG2的细胞来源。体外实验方面，分离培养原代HIMF，应用特异性TG2抑制剂干预，检测其TG活性、细胞外基质沉积水平及TGF-β1活性；同时结合批量RNA测序 (Bulk-RNAseq) 和单细胞RNA测序 (scRNAseq) 技术挖掘并功能验证TG2介导的促纤维化新信号通路。体内实验方面，构建了全局诱导型TGM2条件性敲除 (cKO) 小鼠，在DSS和TNBS诱导的急、慢性实验性肠道纤维化模型中，系统评估了TGM2敲除对小鼠临床评分、组织炎症程度、细胞外基质沉积及肠壁各层厚度的影响。

CD狭窄组织中总TG活性升高且以TG2为主要来源

既往研究报道CD患者HIMF衍生的ECM中TG2蛋白水平上调，为此我们评估了新鲜切除组织切片中的肠道TG活性。结果显示，狭窄型CD (CDs) 组织中的TG活性显著升高，且高于非狭窄型CD (CDns) 及正常对照；同时，TG活性与组织病理学纤维化程度呈适度相关。为了明确TG2对总TG活性的贡献，使用TG2抑制抗体zampilimab (特异性阻断细胞外活性的单克隆抗体) 处理后，总TG活性几乎降至检测不到的水平，各肠道段中TG2对总TG活性的贡献达87%至100%，表明肠道中几乎所有的TG活性均来源于TG2。此外，UC和CDs组织中的TG2抗原水平及TGM2 (编码TG2的基因) 表达量均较正常对照显著升高。值得注意的是，血浆TG2水平在CDs和对照组之间无显著差异，提示TG2的升高仅限于肠道局部组织。综上所述，CD狭窄组织中TG活性、TG2抗原及TGM2表达均升高，且总TG活性几乎完全由TG2介导，并与纤维化程度相关。

图1 CD狭窄组织中TG2活性增加且与纤维化程度相关

(A) 各组织切片中TG活性的代表性图像及定量对比。 (B) TG活性与组织病理学纤维化/炎症评分的相关性分析。 (C) zampilimab抑制前后组织TG活性的变化。 (D) TG2活性在总TG活性中所占的比率。 (E) 各组织切片中TG2抗原量的代表性图像及定量对比。 (F) 各组织切片中TGM2基因的相对表达量

肠道肌成纤维细胞是TG2的主要来源

研究者通过使用选择性TG2抗体对组织切片进行免疫荧光检测，并以细胞类型特异性抗体复染，以明确TG2的细胞来源。结果显示，α SMA+细胞 (肌成纤维细胞/平滑肌细胞) 与TG2完全共定位，且并非所有间充质细胞均为TG2阳性。此外，TG2与内皮细胞、上皮细胞和巨噬细胞的共定位极少，与白细胞无共定位。综上所述，肠道肌成纤维细胞是TG2的主要来源。

单细胞测序揭示CD狭窄相关肌成纤维细胞亚群高表达TGM2

单细胞RNA测序分析显示，TGM2主要富集于基质区室，其阳性细胞密度及单细胞表达量从正常、非受累CD、CDns至CDs呈递增趋势，以CDs最高。在成纤维细胞中，TGM2在多种与CDs密切相关的特定亚群中表达最强；且TGM2高表达成纤维细胞的ECM基因表达水平显著高于TGM2低表达亚群，这一差异在CDs中尤为明显。这表明CDs相关成纤维细胞亚群具有最高的TGM2表达，且TGM2高表达与高ECM基因表达相关。鉴于TG2的分泌型及酶活性特征，提示TGM2高表达成纤维细胞周围存在促纤维化微环境，其分泌的TG2可能通过自分泌或旁分泌方式导致自身激活。

图2 CD相关肌成纤维细胞是TG2的主要来源

(A) 免疫荧光显示TG2与α-SMA在组织中完全共定位。 (B) 单细胞测序显示TGM2在各细胞区室中的表达分布。 (C) UMAP图及密度图展示基质区室中TGM2+细胞随CD病变进展的分布变化。 (D) 各病变阶段基质细胞中TGM2的每细胞表达量。 (E) 各阶段不同成纤维细胞亚型的TGM2表达水平。 (F) 伪批量分析比较高表达和低表达TGM2成纤维细胞的ECM基因表达差异。

抑制细胞外TG2活性可减少HIMF的细胞外基质产生

接下来研究者测试了HIMF中TG2的促纤维化活性。体外实验表明，HIMF能够分泌有活性的TG，且其衍生的总TG活性中≥95%由TG2引起 (与组织原位观察一致)，同时TG2抑制剂处理不影响细胞形态。进一步使用Z-Don (可同时抑制细胞内外的膜通透性抑制剂)、Boc-Don (仅阻断细胞外活性的非膜通透性抑制剂) 和zampilimab探究细胞外TG2在ECM产生中的作用。结果显示，无论HIMF的供体来源如何，这三种药物均使成熟纤连蛋白 (FN) 的积累降低了50-75%，且三者间无显著差异。此外，Z-Don并未比仅抑制细胞外的药物产生额外的FN抑制效果，表明TG2的促纤维化功能主要由其细胞外ECM结合型TG2所介导。在狭窄型CD中，I、III和VI型胶原的沉积亦增加；同样地，抑制TG2活性可减少成熟FN和这些胶原的积累，且不同抑制剂之间无显著差异。

图3 HIMF分泌的TG活性主要由TG2介导，抑制其活性可减少ECM沉积

(A) Z-Don处理显著降低HIMF的TG活性且不影响细胞形态。 (B) zampilimab处理同样显著降低HIMF的TG活性。 (C) 不同TG2抑制剂均能同等程度地减少各来源HIMF的纤连蛋白沉积。 (D) 不同TG2抑制剂均能减少HIMF的纤连蛋白及I/III/VI型胶原沉积

HIMF批量RNA测序揭示新的TG2信号通路

对经zampilimab或其同型对照处理的HIMF进行批量RNA测序，结果显示，TG2抗体处理样本与对照组明显聚类分离。差异表达分析显示，处理组中有432个基因下调、402个基因上调，且差异表达基因 (DEGs) 聚类分明。其中，ECM相关基因普遍下调，下调最显著的基因包括ECM相关的LTBP4、FBLN1、ADAMTS7以及核蛋白1 (NUPR1)。功能富集分析进一步表明，在TG2抗体处理的细胞中，与成纤维细胞活化、ECM及纤维化相关信号的通路下调，同时与纤维化通路相关的关键转录调节因子NUPR1及与磷脂介导的促纤维化通路相关的SMPD1 相关的通路亦下调。为验证该测序分析的功能相关性，研究选取了SMPD1和NUPR1作为潜在靶标，这两个基因此前均未与TG2信号传导相联系。此外，GO富集分析揭示，由细胞外TG2活性介导的候选基因过度表达，进而诱导了由SMPD1和NUPR1介导的细胞应激与衰老反应。

图4 HIMF批量RNA测序揭示TG2相关的新信号通路

(A) PCA图显示抗体处理组与同型对照组聚类分离。(B)上调和下调的差异表达基因数量。(C)差异表达基因的聚类模式。(D)抗体与同型组中表达变化最显著的前30个基因。(E)全局及ECM基质体相关基因的差异表达情况。(F) zampilimab处理后下调基因富集的生物学通路。

TG2介导信号通路的功能验证

对已发表的scRNAseq数据集分析表明，高表达TGM2的成纤维细胞表现出高频率的细胞间相互作用，并显著富集TGF-β1受体/SMAD、激活素及EMT相关的促纤维化信号，提示其周围可能存在更高水平的活性TGF-β1。研究者推测TG2驱动的HIMF活化是通过促使潜伏型TGF-β1释放为活性形式所介导的，而使用TG2抑制剂处理后，上清液中TGF-β1活性显著降低，证实了这一机制。进一步的功能验证显示，外源性TG2可使FN沉积增加约2倍，而ALK5、AKT、SMPD1或NUPR1抑制剂均能将FN沉积降至基线；此外，在zampilimab抑制细胞外TG2活性的前提下，联合抑制ALK5或阻断AKT并未进一步减少FN沉积。上述结果证实，细胞外TG2可通过上述通路活化HIMF，揭示了涉及ECM调节及TGF-β1依赖性促纤维化通路的新型信号传导机制。

图5 TG2介导信号通路的功能验证

(A) 高表达TGM2的成纤维细胞表现出高频率的细胞间相互作用。(B) 高互作成纤维细胞在CDs中富集TGF-β1及ECM相关通路。(C) TG2抑制剂显著降低HIMF上清液中的TGF-β1活性

体内靶向敲除TGM2抑制实验性肠道纤维化

为在体内探讨TG2对肠道纤维化的影响，研究者构建了cKO小鼠模型，经验证，cKO小鼠肠道的TGM2表达及TG活性在整个实验期间显著降低，证明该模型可用于机制探索。在急性及慢性DSS和TNBS结肠炎模型中，TGM2缺失均未影响小鼠的临床评分、体重减轻及组织病理学炎症评分。然而，在慢性纤维化模型中，与野生型小鼠 (WT) 相比，TGM2 cKO小鼠的间质胶原及COL-I、FN的特异性染色显著减少，同时其结肠壁的增厚程度也明显减轻。上述结果证实，在体内敲除TGM2可在不影响肠道炎症程度的前提下，有效缓解实验性肠道纤维化的进展。

图6 TGM2敲除可预防DSS诱导的实验性肠道纤维化

(A) DSS慢性纤维化模型实验设计图。 (B) WT与cKO小鼠在实验期间的体重变化与临床评分。 (C) WT与cKO小鼠的组织病理学炎症评分。 (D) cKO小鼠肠道COL1、纤连蛋白及间质胶原沉积。 (E) cKO小鼠ECM蛋白沉积显著低于WT。 (F) cKO小鼠肠壁各层厚度显著低于WT

图7 TGM2敲除可预防TNBS诱导的实验性肠道纤维化

(A) TNBS慢性纤维化模型实验设计图。 (B) WT与cKO小鼠在实验期间的体重变化与临床评分。 (C) WT与cKO小鼠的组织病理学炎症评分。 (D) cKO小鼠肠道COL1、纤连蛋白及间质胶原沉积。 (E) cKO小鼠ECM蛋白沉积显著低于WT。 (F) cKO小鼠肠壁各层厚度显著低于WT。

研究证实TG2参与了肠道纤维化的进展，且该过程可能独立于炎症。肠道肌成纤维细胞是TG2的主要来源，肠道中几乎全部的TG活性均由TG2介导，且其活性与组织病理学纤维化程度显著相关。在机制上，TG2通过激活潜伏型TGF-β1，驱动肌成纤维细胞活化与ECM过度沉积；而体内诱导型敲除TGM2可在不影响肠道炎症程度的前提下，有效减轻实验性肠道纤维化的胶原沉积与肠壁增厚。因此，靶向TG2活性不仅为研究肠道纤维化的非炎症依赖机制提供了新视角，也为狭窄型克罗恩病提供了一种极具前景的抗纤维化治疗新策略。

致谢

中南大学湘雅三医院 张婧楠

中南大学湘雅三医院 王思丹

中南大学湘雅三医院 陈杰

中南大学湘雅三医院 王晓艳

对本篇文章解读做出的贡献

参考文献

1.Chandra J, Czarnecki D, Mukherjee PK, West GA, Gordon IO, Plesec T, Wang Y, Lin S, Wang J, Bergin M, Huang L, Mao R, Tam NQ, Liu W, Massey WJ, Banerjee S, Prasad A, Ivanov AI, Gauriloff S, Baker ME, Sleiman J, Falloon K, Beveridge CA, Larsen C, Kessler S, Lavryk O, Lipman J, Holubar S, Hu S, Fiocchi C, Johnson T, Motte C, Rieder F. Myofibroblast Derived Transglutaminase 2 Activity is Upregulated in Stricturing Crohn's Disease and its Inhibition Exerts Anti-Fibrotic Properties. Gastroenterology. 2026 Oct 13:S0016-5085(26)07334-8. doi: 10.1053/j.gastro.2026.09.026. Epub ahead of print. PMID: 42869257.