作者：赵庆祥，王金燕，高勇，滨州医学院附属医院；吴小娟，山东第二医科大学公共卫生学院

慢性疼痛是一类在临床上广泛存在的疾病，常反复发作，剧烈而难忍，这极易引发患者睡眠障碍、抑郁等问题，严重者甚至导致自杀。然而，慢性疼痛机制尚未完全明确，目前尚缺乏显效的治疗手段，故明确其发病机理一直是医学研究的焦点。

细胞程序性坏死(necroptosis， Nec)是一种新近发现的可调控性细胞死亡模式，可被多种生物损伤因子，如炎性因子、脂多糖、氧化损伤、病原体感染等，经由不同的信号蛋白(如TNFR 家族、TLRs 或ZBP1等)启动，这些信号蛋白均存在受体相互作用蛋白激酶同源相互作用序列(receptor interaction protein kinase homology interaction motif， RHIM)结构域，可介导激活受体相互作用蛋白激酶( receptorinteraction protein， RIP3)，RIP3 通过活化Nec 的执行蛋白混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineagekinase domain-like protein， MLKL)促使其易位至细胞膜，诱发细胞离子通道稳态地丧失和质膜破裂而形成Nec。

最新研究表明，Nec 可通过不同的分子机制促使慢性疼痛的发生和发展，对其通路蛋白进行抑制或阻断可显著改善动物模型所形成的疼痛异常行为，此外，RIP3 和MLKL 基因缺失动物在发育期和成年体内没有显示出有害的表型。因此，靶向Nec 可能是一种有效治疗慢性疼痛的新突破口。基于上述背景，本文将着重论述Nec 的激活途径、可能的分子机制以及在慢性疼痛领域中的作用。

1.Nec 的激活途径

Nec 的激活途径非常复杂，可由体内外多种有害刺激所激活，主要包括死亡受体(death receptor ligands， DRs ) 途径和模式识别受体( pattern recognition receptors， PRRs)途径等。

DRs 途径：可引发Nec 的DRs 包括凋亡相关因子配体(factors associated suicide， Fas)、肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor， TNFR)、TNF 相关凋亡诱导连接受体(TNF-related apoptotic induced ligand， TRAIL) 等，其中，TNF-α/ TNFR1 介导的信号通路是目前研究最为清晰和完整的DRs激活途径。TNF-α 与细胞膜表面的TNFR1 结合后，TNFR1 的胞内死亡结构域会募集细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins， cIAPs)、TNF 受体相关因子2(TNF-receptor associated factor 2， TRAF2)和RIP1 等信号分子，形成复合物Ⅰ。

根据接收的信号刺激类型，复合物Ⅰ中的RIP1 蛋白会受到泛素化或磷酸化等不同形式的修饰，从而决定细胞的存活命运。在复合物Ⅰ中，RIP1 会被cIAPs 泛素化，诱导NF-κB (nuclear factor-kappa B， NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase， MAPK)途径，进而发生炎症反应。然而，当配体结合的TNFR 快速内化后，RIP1 会被去泛素化酶去泛素化，这不仅限制了NF-κB 和MAPK 信号转导的持续激活，而且会导致RIP1、胞内死亡结构域、半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)以及Fas 相关死亡结构域蛋白( Fas-associating death domain-containing protein， FADD)等蛋白复合物Ⅱ的形成，引发细胞凋亡。

在复合物Ⅱ 形成过程中， 如果caspase-8 失活或缺失时，会促进RIP1 蛋白的去泛素化，并介导RIP1 与RIP3 蛋白结合，形成坏死小体，导致MLKL 发生寡聚并易位至细胞膜上，诱发细胞Ca2+、Na+等通道稳态地丧失和胞膜对水的通透性增加，最终引发细胞肿胀、质膜破裂和死亡。

PRRs 途径：PRRs 家族是介导Nec 的另外一种重要信号途径，主要包括Toll 样受体家族(Toll-like receptors，TLRs) 和ZBP1/ DAI(Z-DNA bindingprotein 1/ DNA-dependent activator of interferon regulatory factors)途径等。TLRs 是一类位于细胞表面高度保守的PRRs，能够识别多种病原体及炎性因子，其中，在TLRs 诱导的Nec 途径中，研究较为清晰的是TLR4 通路。

细胞在应激损伤或感染状态下，细胞表面TLR4 及其相应配体会被病原相关分子(pathogen-associated molecular patterns， PAMPs ) 或损伤相关分子(damage-associated molecular patterns， DAMPs)所触发，与TNF 诱导的Nec 不同的是，在不依赖于RIP1激酶活性的情况下，TLR4 的激活就可形成一个核内体平台，招募胞质适配器β 干扰素Toll/ 白细胞介素1 受体结构域衔接蛋白(Toll/ interleukin-1 receptor domain containing adaptor protein inducing interferon-β， TRIF)、髓样分化因子88 (myeloid differentiationfactor 88， MyD88)等，其中，TRIF 自身存有RHIM 结构，可促进其与RIP3 的相互作用，诱发MLKL 构象变化和易位至胞膜，形成Nec。与TNF 诱导的Nec类似，活化的Caspase-8 也可以通过切割TRIF 的结构域阻断Nec。

ZBP1/ DAI 是一种可识别天然核酸的PRRs，通过结合病原体或细胞中的异常zDNA 和zRNA，进而触发炎症反应或不同形式的细胞死亡。ZBP1 在Nec 方面的作用，其早期研究主要集中在病毒感染领域，ZBP1 作为病毒RNA 的受体，ZBP1 的N 末端包含两个Z-DNA 结合域，中间含有RHIM，可与RIP3 相互关联，然后招募并激活MLKL 以诱导Nec的发生。

目前，多项研究已证实，ZBP1 介导的Nec 在人体多种疾病中扮演着重要角色，Maelfait等首次报道了在非感染性细胞中高表达的ZBP1可以识别内源性核酸，2020 年，Jiao 等的研究取得了新的突破，ZBP1 对内源性Z-DNA 的识别可引发RIP1 缺陷小鼠发生Nec，诱发皮肤炎症。

此外，Schwarzer 等研究表明，ZBPl 还可以感测内源性配体，并通过抑制FADD-Caspae-8 信号转导来触发Nec，从而导致小鼠结肠炎。在热射病中，热应激通过RIP3 依赖性MLKL 活化诱导细胞Nec 和炎症反应，导致热射病的病理表现，在ZBP1 缺陷但不缺乏RIP3 的细胞中，热应激诱导的各种细胞死亡迹象消失，故ZBP1 是热应激中RIP3 介导Nec 的关键分子。如今，ZBP1 介导的Nec 正日益受到广泛关注，其潜在机制仍在深入的研究中。

尽管触发Nec 的方式各异，但上述Nec 信号通路蛋白均存有RHIM 结构域，其共同的核心环节为含有RHIM 结构域的上游信号蛋白募集和激活RIP3，RIP3 随后介导Nec 的执行者-MLKL 的激活和磷酸化，使其底物MLKL 寡聚化以传递Nec 信号，最终导致细胞破裂死亡。

然而，有研究表明，在严重心肌梗死、心力衰竭等心脏疾病病理条件下，RIP3 可直接介导钙调蛋白依赖性蛋白激酶2(calcium dependent protein kinase2， CAMK2) 的活化，而非依赖于MLKL，进而触发线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore， mPTP)的开放，诱发Nec 并导致心肌损伤。因此，在不同的应激条件下和不同的细胞内，Nec 激活途径可能是迥然有别的，故仍需进行更深入的探索。

2.Nec 的分子机制

炎症反应： 炎症反应是驱动慢性疼痛形成的关键机制之一，而Nec 可直接或间接地引发炎症反应，其主要机制可能概括为释放危险相关模式分子(damage associated molecular patterns， DAMPs)、激活NLRP3(nucleotide binding and oligomerization domain-like receptor protein3， NLRP3)炎性小体以及小胶质细胞极化状态的改变等。

首先，发生Nec 的细胞会释放大量具有免疫原性的DAMPs，被认为是引发炎症反应的关键诱因，多项研究已证实，当细胞破裂时，其核内(如DNA 片段、组蛋白、高迁移率族蛋白)、细胞质(如热休克蛋白、腺苷三磷酸)、内质网相关的钙蛋白、线粒体相关DNA 等诸多DAMPs 分子大量释放，而后它们会被巨噬细胞等固有免疫细胞上的PRRs 识别并通过胞饮摄取，触发免疫炎症反应，而经过选择性RIP3 药物抑制或MLKL 特异性敲除的动物模型，Nec 的发生情况和产生的DAMPs 均明显减少，炎症反应也获得明显改善。

其次，NLRP3 炎性小体是细胞内一种多蛋白复合物，可促进白细胞介素-1β(interleukin-1 beta， IL-1β)和IL-18 的成熟和分泌，继而引发机体的炎症反应，是近年的研究热点。NLRP3 炎性小体的活化和Nec 信号途径的发生存在着不可分割的联系，一方面，发生Nec 的细胞可以通过破裂的质膜将DAMPs 释放到细胞外的空间，触发NLRP3 炎性小体的活化，另一方面，Conos 等研究表明，Nec 还可通过易位至细胞膜的MLKL，诱发细胞钾离子通道稳态的丧失，以一种细胞内在的方式触发巨噬细胞中NLRP3 炎性小体的成熟，Nec 信号蛋白RIP3或MLKL 的缺失则会阻碍NLRP3 炎性小体的活化和ASC 的寡聚化。Wang 等研究表明， RIP1/RIP3 复合体还可通过激活鸟苷三磷酸酶促进线粒体分裂蛋白1 向线粒体内转运，从而活化NLRP3 炎性小体，诱发炎症反应。

最后，小胶质细胞是神经系统中的宿主免疫细胞，可被活化并表现出不同的极化状态，其中，M1表型具有促炎性特征，会产生一系列炎性介质，促进炎症进程，与之相比，M2 表型则被视为具有抗炎作用，产生和释放一些抗炎因子。胶质细胞的极化状态与慢性疼痛的发生密切相关，而Nec 也能够对小胶质细胞的极化状态产生影响。

Yang 等脑缺血相关研究表明，抑制RIP3 或MLKL 蛋白活性可使小胶质细胞从M1 型转换为M2 型。另一方面，Ma等的数据证实，紫杉醇能够促进大鼠神经系统中小胶质细胞向M1 型转变，并进一步促使大鼠神经元细胞发生Nec，引发慢性疼痛，这表明Nec 也会因小胶质细胞极化状态的转变而诱发。然而，此类研究相对较少，其潜在机制仍需进行更深入的研究。此外，RIP1 或RIP3 活化也可直接参与诱导炎性基因的表达，而不依赖于Nec。目前，由于靶向Nec 显示出干预炎症性疾病的强大潜力，靶向Nec信号通路或许能为未来治疗炎症相关性疼痛提供新的路径。

活性氧簇： 活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)已被普遍证实可通过直接氧化细胞器或引发多条下游通路介导慢性疼痛的形成。早期的研究者们已经观察到，在Nec 过程中，当细胞形态尚未产生显著的变化时，ROS 就已出现，在细胞膜破裂时，胞内的ROS 浓度达到高峰，引发氧化爆发。

有关Nec 过程中伴随着ROS 生成的实验证据愈发增多，在一项高糖诱发心肌细胞损伤的研究中显示，应用Nec-1 能明显下调高糖引起的心肌细胞Nec 和ROS 蓄积。Lu 等关于紫草素诱导癌细胞死亡的研究表明，用Nec-1 或RIP3 特异性抑制剂GSK-872预处理，不仅能阻止紫草素诱导的胶质瘤细胞Nec，而且能显著降低细胞内ROS 的蓄积，而采用NAC预处理胶质瘤细胞抑制ROS 活动，可明显拮抗紫草素对RIP1/ RIP3 蛋白的上调和结合，这表明Nec 和ROS 之间的相互作用可能是紫草素抑制胶质瘤细胞的一种新机制。

徐婷婷等的研究表明， 在TNF-α 诱导的T293 细胞Nec 中，参与氧化呼吸链和三羧酸循环的糖原磷酸化酶、谷氨酸氨基连接酶以及谷氨酸脱氢酶等一系列关键酶类，被RIP3 过度激活，从而导致氧化磷酸化过程的加速，并催生大量的ROS，这表明Nec 的关键蛋白RIP3 具有促进线粒体代谢的作用，从而进一步促进ROS 的生成与积累，其研究组后续研究进一步揭示，线粒体外ROS 或通过氧化磷酸化产生的线粒体ROS 可修饰RIP1 的C257、C268 和C586 残基，并促进RIP1 在S161 处的自磷酸化，导致RIP3 的募集和Nec 的发生，证实了ROS 和Nec 之间的串扰可形成正反馈回路。

近期，相关研究亦表明，RIPK1/ RIPK3/MLKL 坏死复杂体可穿梭到线粒体外膜，激活线粒体磷酸甘油酸突变酶5，进一步参与诱导激活动力蛋白1(dynamin-related protein 1， Drp1)，促进线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transitionpore， mPTP) 开放，导致线粒体崩溃和高水平的ROS 释放。但在HT-29 细胞系中的研究却表明，TNF-α+Smac 类似物+zVAD 导致的Nec 与ROS 无关，线粒体ROS 的产生仅仅是伴随现象，故Nec 与ROS 的关系还需进一步的研究证实。

细胞自噬： 细胞自噬在神经系统中承负着多种至关重要的功能，不仅可清除老化细胞器和病理蛋白，以有效地保护神经细胞免受损伤，而且还可调节细胞代谢，促进神经组织的修复与再生，故自噬被认为是神经系统对抗各种刺激源的细胞基本生物学过程，这一关键特征使自噬功能障碍会导致病理蛋白质聚集和细胞器异常，而引发多种疼痛相关疾病，如奥沙利铂诱发的疼痛、神经损伤相关疼痛和糖尿病痛性病变等。

在近期的多项研究指出，Nec 与自噬存有紧密的交叉联系。Zeng 等的研究表明，P62/ SQSTM 1 是一种自噬适配体蛋白，可与LC3 结合形成自噬小体，将病理蛋白质、异常细胞器等选择性地引导至自噬溶酶体中进行降解清除，然而，在脑缺血-再灌注损伤后，RIP1/ RIP3 通路蛋白被激活，阻止了P62 介导的自噬小体降解，大量未降解的自噬小体会被外泌体或微囊泡包裹并分泌到细胞外，引发炎症级联反应，在使用RIP1/RIP3 通路抑制剂Nec-1 后，RIP1 活性及与RIP3 的聚合受到明显遏制，可加速自噬溶酶体的发生，并显著促进P62 介导自噬小体的降解。

且近期研究表明，在TNF-α 处理的小鼠L929 成纤维细胞中，激活的MLKL 通过阻断自噬-溶酶体的降解功能来促进Nec 的发生，在急性肾脓毒损伤模型中也证实了这一观点，上调的RIP3 会导致自噬小体在肾近端肾小管上皮细胞中的积累，形成Nec 和炎症反应。另一方面，自噬障碍也会加剧Nec 的形成。

Liu 等的研究表明，在脊髓损伤动物模型中，自噬障碍会导致Nec 关键蛋白RIP1、RIP3、MLKL 等快速积累，恢复自噬功能则有助于调控Nec 通路蛋白的活性，抑制Nec 的发生并降低炎性因子水平；Xu等进一步发现，在阿尔茨海默病小鼠模型中存有p62 异常积累，这代表了自噬功能受损，累积的p62会招募RIP1，激活下游的RIP1/ RIP3/ MLKL 级联反应，最终导致神经元细胞发生Nec，故探索Nec 与自噬之间的交互作用机制可能为治疗慢性疼痛提供一种新颖而有效的方向。

其他： 细胞焦亡等其他类型的细胞程序性死亡形式等可能也参与了Nec 促使慢性疼痛发生发展的过程，但此类研究相对较少，需进一步明确其在慢性疼痛形成中的分子机制细节。

3.Nec 在慢性疼痛中的作用

神经病理性疼痛： 神经病理性疼痛(neuropathic pain， NP)是慢性疼痛最常见的类型之一，但机制十分复杂，临床治疗相对困难。王楠楠等通过建立坐骨神经慢性缩窄损伤(chronic con-striction injury， CCI)模型揭示了Nec 在NP 形成中的作用，研究结果表明，CCI 造模7 d 可观察到脊髓RIP1 和RIP3 蛋白含量显著上调，脊髓中可见多处核膜崩解、细胞器破溃等细胞Nec 现象，鞘内注射RIP1 的特异性小分子抑制Nec-1 可显著降低CCI诱导的大鼠异常疼痛行为，这表明Nec 的形成对CCI 诱导的NP 至关重要，这一结果得到了张秀梅等研究的证实。

Pu 等研究表明，在CCI 大鼠结扎后的第8 天，RIP1 和RIP3 在CCI 大鼠的背根神经节( dorsal root ganglion， DRG)、脊髓背角(spinal dorsal horn， SDH) 和海马中高表达，提示Nec 可能在NP 的不同组织水平中均发挥重要作用。He 等则进一步评估了RIP3 在CCI 诱导的NP 中的作用，结果显示，RIP3 特异性抑制剂GSK，不仅可改善CCI 大鼠的热痛阈值和机械性异位痛，而且还可降低了脊髓中炎性因子水平，推测RIP3可能是NP 治疗的关键干预点。

一项关于CCI 后胶质细胞和突触传递动态变化的研究表明，CCI 后SDH 的突触传递功能以时间依赖性的方式改变，并伴有星形胶质细胞增殖，以及神经元细胞Nec 的现象，在这种情况下，通过短期抑制星形胶质细胞的活性，可以有效下调脊髓神经元Nec 的发生，模型动物的疼痛相关行为也会获得改善。选择性神经损伤(spared nerve injury， SNI) 模型也是一种常用的动物NP 模型，其特点是机械性痛觉敏感出现早、持续时间长。

罗雀华等的研究表明，SNI 可触发SDH 中Nec 关键蛋白RIP1/ RIP3/MLKL 的表达升高，并伴有促炎因子的异常分泌，而鞘内注射Nec-1 后可显著降低SDH 中RIP1/ RIP3/MLKL 蛋白表达和促炎因子水平，这提示Nec 及所诱发的促炎因子释放在SNI 引起的NP 中具有重要作用。在另一项关于大鼠SNI 的研究表明，SNI诱导的周围神经损伤会增加SDH 中RIP3 蛋白的表达和小胶质细胞活化水平，且RIP3 与小胶质细胞共表达，给予Nec-1 干预后，SDH 中促炎细胞因子和RIP1/ RIP3 的蛋白水平显著降低，小胶质细胞的数量也明显减少，同时SNI 模型动物的异常性疼痛也获得改善，这些结果表明，小胶质细胞内RIP3 通过促进Nec 的发生，驱动了NP 的发生。

化疗在恶性肿瘤的治疗中被广泛应用，然而接受化疗后，约30% ~70%的患者会出现剧烈的NP，不仅加重患者的心理负担，还会限制化疗药物的应用，严重甚至导致化疗的终止。一项紫杉醇诱导大鼠NP 的研究表明，应用紫杉醇会引起DRG 中RIP3/ MLKL 依赖性神经元Nec，并增加促炎细胞因子的分泌，最终导致NP 的发生，使用Nec-1 后则显著抑制RIP3 和MLKL 的活性，并明显减轻紫杉醇诱导的Nec 和炎性因子水平，大鼠的NP 也获得减轻，上述证据表明，靶向RIP3/ MLKL 依赖性Nec 可能是治疗化疗诱发NP 的一个重要方向。

随后，在紫杉醇诱导的大鼠NP 中，巨噬细胞活化后所释放的TNF-α 是神经元发生Nec 的重要调控信号，给予巨噬细胞清除剂(氯膦酸二钠)后，能够有效减轻NP大鼠DRG 中的巨噬细胞浸润，并下调p-MLKL 水平和降低细胞中的Nec 数量，从而减轻异常疼痛行为。Nec 的激活可能有助于阐明NP 复杂的分子机制，调控Nec 相关蛋白的活性可能是治疗NP 的一种有效方法。

炎性疼痛： 炎性疼痛也是一种临床常见的慢性疼痛，因其发病机制复杂，临床治疗较为棘手。Rahmani 等的实验表明，炎性疼痛引起的记忆损伤可能与RIP3 介导的小胶质细胞数量增多以及神经炎症水平上调有关。Zhang 等则通过观察RIP3 在电针治疗炎性痛中的作用，结果表明，RIP3可通过触发NLRP3 炎性小体的激活，驱动炎性疼痛的形成，而应用电针可抑制RIP3 活性和NLRP3 炎性小体成熟，从而改善痛觉阈值，提示RIP3-NLRP3炎性小体信号轴可能是炎性疼痛发生的关键。

慢性疼痛是骨性关节炎(osteoarthritis， OA)患者最常见的症状之一，其也被视为炎性痛的一种重要表现形式。Cho 等研究表明，Nec 的关键蛋白可通过产生促炎因子和基质金属蛋白酶-3，参与软骨退化和滑膜炎症等OA 相关疼痛的病理过程。Cheng 等的研究则进一步表明，在OA 患者的软骨组织中可观察到典型的细胞Nec 形态，RIP1 在OA 患者和大鼠OA 模型的软骨中均显著上调，关节内RIP1 的过表达能够诱导大鼠软骨的结构缺陷和功能障碍，而借助Nec-1 抑制RIP1 的活性后，可有效保护大鼠免受创伤诱导的软骨退化和关节疼痛，这些研究数据明确了RIP1 在介导软骨细胞Nec 和破坏细胞外基质代谢稳态过程中的重要作用。

Jeon等研究表明，RIP3 在OA 患者受损软骨中的表达明显高于未受损的软骨组织，在小鼠OA 模型中，通过腺病毒载体使RIP3 过表达可加速软骨破坏，而RIP3 的缺失则可减少OA 小鼠的发病率和抑制异常疼痛。因此，Nec 在炎性疼痛中发挥了关键作用，特别是OA 相关的疼痛，故靶向Nec 及其关键蛋白可能是减轻炎性痛的有效策略。

4.小  结

慢性疼痛的形成机制极为复杂，是多方聚焦却尚未攻克的难点，Nec 的研究可能为明确慢性疼痛的发病机制提供了新方向。然而，在慢性疼痛领域，对Nec 的相关研究主要呈现在表面现象方面，缺乏对其机制的全面、深入地研究，且在某些类型的慢性疼痛中Nec 的作用还仍未得到验证。因此，未来的研究重点应该在于详细探讨Nec 在慢性疼痛中的致病机制以及负性调节因素，并进行严格的实验研究确定Nec 在某些慢性疼痛中的作用。

来源：赵庆祥，吴小娟，王金燕，等.细胞程序性坏死在慢性疼痛中作用的研究进展[J].临床麻醉学杂志，2025，41(08)：870-875.